生物薄膜DNA、RNA提取要點(diǎn)

時(shí)間：2020-01-05

作者：Suzanne kennedy 來(lái)源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室

早前的文章我們討論過(guò)了生物薄膜（biofilm）樣品的基本特性以及影響樣品制備和處理方法的因素。今天我們與你分享提取生物薄膜樣品DNA或RNA的幾個(gè)要點(diǎn)。下面列是我們處理了大量各種類(lèi)型生物薄膜和微生物墊（biomats）總結(jié)出來(lái)的，以及與我們聯(lián)合共同開(kāi)發(fā)PowerBiofilm Kit的科學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)。

下面的列表會(huì)隨著對(duì)生物薄膜的繼續(xù)深入研究或遇到新類(lèi)型有趣的樣品而可能增加。如果你的樣品非常難處理，聯(lián)系我們，或者可以給你好的建議。

1）少加樣。當(dāng)使用2ml Bead Tubes小量提取時(shí)，加樣量控制在0.05-0.2g。有些研究者通過(guò)自己實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期摸索優(yōu)化，加樣量有達(dá)到0.25-0.3g的。使用**過(guò)建議加樣量常常會(huì)導(dǎo)致提不到核酸（見(jiàn)*三點(diǎn)）。建議加樣量不是指導(dǎo)范圍而是裂解溶液化學(xué)物的較優(yōu)處理范圍。過(guò)量加樣會(huì)影響生物薄膜生長(zhǎng)基質(zhì)的去除和細(xì)胞裂解。

2）使用試劑盒提供研磨珠套管。PowerBiofilm 的研磨珠套管是經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)適應(yīng)裂解溶液化學(xué)物工作的。它不是簡(jiǎn)單的研磨珠混搭。外容器Tube本身非常堅(jiān)硬，可適用于普通的渦旋振蕩和強(qiáng)力高速珠磨研磨機(jī)，不會(huì)中途破裂。請(qǐng)不要把研磨珠轉(zhuǎn)移到其它Tube管中使用。有些人未曾用過(guò)不透明的研磨珠套管，不過(guò)把離心后碎片等會(huì)沉淀下來(lái)，轉(zhuǎn)移上清不會(huì)很困難。去嘗試，如果有困難請(qǐng)隨時(shí)聯(lián)系我們。

3）不要**時(shí)研磨。使用你實(shí)驗(yàn)室常規(guī)研磨均質(zhì)設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置不一定較好，有可能過(guò)分研磨。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，加長(zhǎng)樣品研磨時(shí)間或較大的研磨強(qiáng)度并不能提高得率。隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng)和強(qiáng)度的增加，多糖和其它**/無(wú)機(jī)成分容易形成粘稠的裂解物。絕大多數(shù)這類(lèi)物質(zhì)不可溶，且會(huì)吸附核酸，導(dǎo)致核酸丟失。如果研磨完畢可轉(zhuǎn)移的裂解物少于400μl，那么就是研磨太過(guò)了。高速研磨30s比較合適。

4）使用適量洗脫液。這條適用于使用二氧化硅濾膜過(guò)濾柱進(jìn)行洗脫。較好的洗脫液體積是100μl。這個(gè)量可讓核酸充分洗脫下來(lái)。均勻加到濾膜上的話，50μl較小量也還能保證核酸洗脫效率，不過(guò)100μl能獲得較充分洗脫。使用小于50μl會(huì)嚴(yán)重影響核酸得率。請(qǐng)記住，稀釋的核酸可通過(guò)濃縮縮小體積。

5）不要以為所有生物薄膜（biofilm）和生物墊（biomats）都差不多。有些生物薄膜雜質(zhì)很多微生物很少，得率遠(yuǎn)沒(méi)有想象中的那么高。若洗脫后分光光度計(jì)測(cè)不出來(lái)DNA或RNA，加樣量沒(méi)有**出建議值，也沒(méi)有研磨太過(guò)，也許只是核酸濃度非常低。你仍然有可能通過(guò)PCR檢測(cè)得到（見(jiàn)*六點(diǎn)）。若對(duì)你的生物薄膜樣品不太了解，與預(yù)期得率差異很大，請(qǐng)聯(lián)系我們，或者可以給出更多優(yōu)化建議。關(guān)于一些生物薄膜和生物墊的常規(guī)得率，點(diǎn)擊這里（biofilm_apnote）。

6）凝膠電泳和PCR共同評(píng)估核酸。使用紫外光檢測(cè)得率，許多因素會(huì)影響讀數(shù)的準(zhǔn)確性。腐植酸和污染的RNA可明顯推高A260。DNA碎片比完整DNA片段讀數(shù)要高。凝膠電泳可較好檢驗(yàn)分光光度計(jì)的結(jié)果。因?yàn)?/span>PowerBiofilm使用了IRT技術(shù)（抑制因子去除技術(shù)），獲得的核酸非常純凈，所以若讀數(shù)較低，也要比未經(jīng)有效純化DNA和RNA得到的結(jié)果較準(zhǔn)確。如果凝膠電泳看不到條帶，嘗試PCR擴(kuò)增。使用了IRT技術(shù)的PowerBiofilm Kit能保證擴(kuò)增的成功率，這點(diǎn)明顯區(qū)別于其它提取方法。

小結(jié)：

希望上述的幾條建議能幫助正在努力奮斗提取此珍貴樣品生物學(xué)信息的你。花費(fèi)大量時(shí)間和金錢(qián)長(zhǎng)途跋涉采樣辛苦勞累，我們懂！希望你們?cè)囼?yàn)?zāi)艹晒?。后面?huì)發(fā)布更多技術(shù)要領(lǐng)。也歡迎你與我們風(fēng)險(xiǎn)處理生物薄膜的心得和技巧。

詞條
詞條說(shuō)明
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