*熒光實(shí)驗(yàn)——iPSC-derive神經(jīng)元的體外神經(jīng)毒性檢測(cè)

時(shí)間：2016-06-16作者：衢州新芝生物科技有限公司瀏覽：815

如今神經(jīng)毒性檢測(cè)主要是依賴活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不僅有倫理問(wèn)題，而且通常非常昂貴并且十分耗時(shí)。當(dāng)需要大規(guī)模的測(cè)試化合物的時(shí)候就不太合適了。因此，高通量的體外的神經(jīng)毒性測(cè)試就顯得十分必要了，而且可以使用人源的細(xì)胞直接進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性也較佳。但是，到目前為止，人源干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元并沒(méi)有適合進(jìn)行這類試驗(yàn)的特質(zhì)，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，批次間差異大，并且有收到倫理和一些法律的制約，使得這種細(xì)胞都不太適用于做大規(guī)模的體外測(cè)試試驗(yàn)。較近，市面上出現(xiàn)了商用的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞，重復(fù)性好，可以用來(lái)做這類的體外神經(jīng)毒性試驗(yàn)。
荷蘭的科學(xué)家使用人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞做了*熒光染色試驗(yàn)，作為高通量進(jìn)行體外的神經(jīng)細(xì)胞毒性檢測(cè)的預(yù)試驗(yàn)。由不同供應(yīng)商提供的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞混合培養(yǎng)能夠形成不同（*型或抑制型）神經(jīng)元共培養(yǎng)的樣本。
 
ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091
Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?
Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.
 
一、實(shí)驗(yàn)材料
1）細(xì)胞： iCell? Neurons （NRC-100-010-001，Cellular Dynamics international）
          CDI iCell? Astrocytes（Cellular Dynamics international）
          HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)
          DOPA.4U? neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)    
2）培養(yǎng)基：Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)
3）試劑： Poly-L-Ornithine （[PLO] 0.01%）
4）培養(yǎng)耗材：μ-Slide 8孔腔室載玻片，ibiTreat底部處理 （ibidi，Germany，80826）
 
二、實(shí)驗(yàn)方法
一）載玻片包被
①　每孔加入300μl 的  0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液
②　室溫孵育60分鐘
③　吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用
二）*熒光實(shí)驗(yàn)
1）鋪細(xì)胞：
iCell? Neurons 每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞
iCell? Neurons/CDI iCell? Astrocytes共培養(yǎng)，每孔鋪66000個(gè)細(xì)胞
HIP neurons 每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞
DOPA.4U? neurons 每孔鋪52000個(gè)細(xì)胞
DOPA.4U? neurons/iCell? Astrocytes共培養(yǎng)，每孔鋪48000個(gè)細(xì)胞
 
2）加入約300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，靜置15分鐘
3）加入300μl 1% Triton? X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘
4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封閉20分鐘
5）依次加入一抗，二抗進(jìn)行*熒光染色后，沖洗小室并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察（圖二）。
 
圖二：圖示鋪細(xì)胞，固定，清洗，染色步驟。
 
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
 
 
圖三：iPSC-derive神經(jīng)元的*熒光染色結(jié)果。不同種類的人源iPSC-derive神經(jīng)元使用β(III)tubulin（綠色）和GFAP（紅色），用來(lái)區(qū)分神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞（HIP? neurons, 左上；DOPA.4U? neurons，左下；iCell neurons，右上。） Human iCell 神經(jīng)元用vGAT (綠色) 和vGluT (紅色)確定抑制或*突觸（右下）。細(xì)胞核使用DAPI染色（藍(lán)色）。


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