奧林巴斯顯微鏡熒光激發(fā)和**基礎(chǔ)概述

時間：2020-03-19作者：蘇州思凱得電子科技有限公司瀏覽：984

由于其新穎的電子配置，熒光染料具有*特和特征的吸收光譜（通常類似于激發(fā)）和**。這些吸收和**光譜顯示相對熒光強度，相對強度在縱軸上經(jīng)典繪制，而在橫軸上為波長。對于給定的熒光染料，制造商指出照射激發(fā)強度的峰值的波長和熒光**強度的峰值的波長。重要的是要了解顯示給定熒光染料的激發(fā)和**光譜的圖和曲線的來源。

為了確定特定熒光染料的**光譜，確定較大吸收的波長（通常與激發(fā)較大值相同）并且在該波長下激發(fā)熒光染料。典型熒光染料的吸收光譜如圖1（a）所示，其中吸收的相對強度相對于測量的波長作圖。然后使用單色器（允許窄帶光波長通過的裝置）掃描整個**波長系列上的熒光**強度。在各種波長下測量熒光的相對強度以繪制**光譜，如圖1（b）所示。該激勵通過監(jiān)測較大強度波長的熒光**，同時熒光團通過連續(xù)的波長組激發(fā)，以類似的方式確定給定熒光染料的光譜。選擇**較大值，并且僅允許該波長的**光通過檢測器。在各種激發(fā)波長下誘導(dǎo)激發(fā)（通常通過單色器），并測量**熒光的強度作為波長的函數(shù)。結(jié)果是曲線圖或曲線（如圖1（a）所示），其描繪了激發(fā)波長譜上的激發(fā)產(chǎn)生的相對熒光強度。

可以從典型的激發(fā)和**曲線或光譜組中進行若干觀察。在激發(fā)光譜的較高波長端和**光譜的較低波長端之間通常存在重疊。必須通過適當選擇激發(fā)濾光片，二色分束器（反射光熒光）和阻擋或**，在熒光顯微鏡中消除激發(fā)和**強度和波長的重疊（如圖1（c）所示）。過濾。否則，較亮的激發(fā)光會淹沒較弱的**熒光并顯著降低樣本對比度。

當電子從激發(fā)態(tài)進入基態(tài)時（參見下面標題為分子解釋的部分），振動能量就會喪失。結(jié)果，**光譜偏移到比激發(fā)光譜較長的波長（波長與輻射能量成反比）。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯定律或斯托克斯移位。斯托克斯位移越大，將激發(fā)光與**光分離越容易。**強度峰值通常**激發(fā)峰值，并且**曲線通常是激發(fā)曲線的鏡像，但是移位到較長的波長。為了獲得較大熒光強度，通常在激發(fā)曲線的峰值處的波長處激發(fā)熒光染料，并且在**曲線的峰值波長（或觀察者選擇的其他波長）處選擇**檢測。激發(fā)波長和**波長的選擇由適當?shù)臑V波器控制。在確定光學(xué)系統(tǒng)的光譜響應(yīng)時，

典型的熒光染料吸收 - **光譜圖如圖2所示。注意，吸收的熒光強度曲線（通常類似于純化合物的激發(fā)曲線）和這種典型熒光染料的**曲線在形狀上有些相似。激發(fā)和**之間的波長偏移自19世紀中葉以來就已為人所知（斯托克斯定律）。還要注意，激發(fā)和**曲線在激發(fā)的上端和**曲線的較低波長處稍微重疊。

激發(fā)和**波長的分離是通過適當選擇濾光片來阻擋或通過光譜的特定波長來實現(xiàn)的，如圖3所示。熒光照明器的設(shè)計基于通過易于更換的濾光片插入控制激發(fā)光和**光在朝向樣品的途中進入光路，然后從樣品中散發(fā)出來?？紤]到低**強度，重要的是選擇用于激發(fā)的光源具有足夠的亮度，使得相對弱的**光可以較大化，并且選擇具有令人滿意的吸收和產(chǎn)率的熒光染料。

熒光染料吸收激發(fā)光的效率稱為消光系數(shù)。消光系數(shù)越大，在給定波長區(qū)域中光吸收的可能性越大（確保熒光**的先決條件）。**光的產(chǎn)率被稱為**產(chǎn)率，**的**（“能量包”）的數(shù)量與吸收的**數(shù)量的比率（通常產(chǎn)率在0.1和0.9之間）。**產(chǎn)率**1是通過非輻射途徑（例如熱或光化學(xué)反應(yīng)）而不是熒光的再輻射途徑損失能量的結(jié)果。下表1中列出了一組選定的熒光染料的熒光**產(chǎn)率。

復(fù)合	溶劑	激發(fā)波長 （nm）	**波長 （nm）	**產(chǎn)率
吖啶橙	乙醇	493	535	0.46
苯	乙醇	248	300-350	0.04
葉綠素a	乙醇	440	685	0.23
曙紅	水	521	544	0.16
熒光素	水	437	515	0.92
羅丹明-B	乙醇	555	627	0.97

消光系數(shù)，**產(chǎn)率，光源的平均發(fā)光強度和熒光壽命都是影響熒光**強度和效用的重要因素。此外，熒光染料周圍的局部環(huán)境在確定熒光**特征中起著至關(guān)重要的作用。諸如溶劑粘度，離子濃度，pH和環(huán)境中的疏水性之類的變量可以對熒光強度和激發(fā)態(tài)的壽命產(chǎn)生深遠的影響。

熒光的分子解釋

熒光活性有時以圖解方式描繪，如圖4（a）所示（稱為Jablonski能量圖）。在激發(fā)之前，分子的電子構(gòu)型被描述為處于基態(tài)。在吸收通常具有短波長的激發(fā)光的光子時，電子可以被提升到較高的能量和振動激發(fā)態(tài)，該過程可能僅花費十億分之一秒（通常被稱為飛秒的時間段，10E- 15秒）。

在熒光中，在大約萬億分之一秒（皮秒或10E-12秒）的間隔期間，受激電子可能會失去一些振動能量到周圍環(huán)境并返回到所謂的較低激發(fā)單重態(tài)。從較低激發(fā)單重態(tài)開始，電子能夠“弛豫”回到基態(tài)，同時**熒光，如圖4（a）所示。**的光總是具有比激發(fā)光（斯托克斯定律）較長的波長，并且只要激發(fā)光照射熒光樣品就繼續(xù)**。如果激發(fā)的激發(fā)輻射停止，則熒光停止。

偶爾激發(fā)的電子，而不是通過振動相互作用放松到較低單重狀態(tài)，進行禁止過渡在輻射**可能顯著延遲到幾秒或較長時間的過程中，離開三重態(tài)然后到達基態(tài)。這種現(xiàn)象是磷光的特征，如圖4（b）所示。在一些情況下，受激電子可以從三重態(tài)返回到較低激發(fā)單重態(tài)，然后返回基態(tài)，隨后**熒光。這種作用比通常的熒光需要較長的時間（大約一微秒或兩微秒），稱為延遲熒光（圖4（c））。在其他情況下（例如，光漂白或重金屬或其他化學(xué)品的鹽的存在），**的光可以顯著減少或完全停止，如下所述。

褪色或光漂白

有一些特定條件可能會影響激發(fā)熒光團對光的再輻射，從而降低熒光強度。這種**強度的降低通常稱為褪色或光漂白。一些作者進一步將褪色細分為淬火和漂白。由于在分子氧存在下的光強度，漂白是熒光分子的不可逆分解。猝滅還導(dǎo)致熒光強度降低，并且經(jīng)常由于氧化劑或重金屬或鹵素化合物的鹽的存在而產(chǎn)生。

通常，猝滅是由于能量轉(zhuǎn)移到物理上靠近激發(fā)的熒光團的其他受體分子，這種現(xiàn)象稱為共振能量轉(zhuǎn)移。這種特殊現(xiàn)象已成為測量遠**光學(xué)顯微鏡橫向分辨率的距離的新技術(shù)的基礎(chǔ)。

漂白的發(fā)生導(dǎo)致了一種稱為FRAP的技術(shù)，或光漂白后的熒光恢復(fù)。FRAP基于短激光爆發(fā)的漂白和隨后觀察熒光團擴散到漂白區(qū)域引起的熒光恢復(fù)。

流行抗褪色試劑的性質(zhì)

Antifade Reagent	注釋
對苯 二胺	FITC較有效的試劑。對羅丹明也有效。應(yīng)調(diào)節(jié)至甘油/ PBS中的0.1％對苯二胺用于使用。試樣在暴露于光線下會變黑，因此應(yīng)將其存放在黑暗的地方。皮膚接觸非常危險。
DABCO （1,4-二氮雜 環(huán)庚-2,2,2-  辛烷）	對FITC非常有效。雖然它的效果略**對苯二胺，但它較耐光，并具有較高的安全性。
正丙酯	羅丹明較有效的試劑，對FITC也有效。應(yīng)調(diào)節(jié)至甘油/ PBS中的1％丙基丙酸酯用于使用。
2-巰基 乙胺	用于觀察用碘化丙錠，吖啶橙或Chromomysin A3染色的染色體和DNA標本。應(yīng)在Tris-EDTA中將其調(diào)節(jié)至0.1mM 2-巰基甲胺


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