河北衡水醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房檢測費(fèi)用

    PCR實(shí)驗(yàn)室是指能在短時間內(nèi)擴(kuò)增出目的基因片段的生物工程技術(shù),應(yīng)用于病毒檢測、病原體快速鑒定、個體識別、遺傳診斷及基因等領(lǐng)域。

    在此次中, PCR實(shí)驗(yàn)室主要應(yīng)用的技術(shù)包括:病毒全基因組擴(kuò)增與測序、核酸雜交技術(shù)與熒光原位雜交技術(shù)等。

    下面是關(guān)于 PCR實(shí)驗(yàn)室檢測的相關(guān)內(nèi)容,希望能對您有所幫助。

    PCR實(shí)驗(yàn)室檢測可分為:樣本前處理和樣本后處理兩個部分:

    本文主要介紹樣本前處理中的 PCR實(shí)驗(yàn)室檢測,如有需要也可查看參考文獻(xiàn)或咨詢相關(guān)專業(yè)人士。

    由于試劑盒等不能保證完全覆蓋實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們需要根據(jù)實(shí)際情況做一些針對性處理,如:核酸擴(kuò)增的條件是否合適、實(shí)驗(yàn)試劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響程度、實(shí)驗(yàn)室人員技術(shù)水平以及實(shí)驗(yàn)室空間等因素都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    一、PCR擴(kuò)增條件

    1.水: PCR擴(kuò)增的過程中,由于核酸濃度高,需要大量清水,一般采用無菌水進(jìn)行稀釋到10-50 mg/mL范圍內(nèi);

    2.電泳主要是通過施加電壓讓 DNA聚合酶與模板進(jìn)行化學(xué)結(jié)合,在一定時間內(nèi)將模板復(fù)制出來;

    3.引物的種類、濃度以及長度對 PCR結(jié)果有很大影響;

    4.模板: PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果受模板的影響比較大,因此 PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的模板庫。

    5. Taq酶:如果實(shí)驗(yàn)用 Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增,需根據(jù) DNA反應(yīng)體系選擇適當(dāng)?shù)?Taq酶;

    6.擴(kuò)增產(chǎn)物的分析: PCR實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物可通過質(zhì)譜檢測(LC-MS/MS)。

    二、試劑的選擇

    實(shí)驗(yàn)中常用的試劑有: DNA凝膠電泳試劑(如: PAGE、SDS-PAGE、 SV或SPE-PCR等)和熒光定量 PCR試劑(如 MassA等)。

    DNA凝膠電泳和熒光定量 PCR所用探針的選擇與其擴(kuò)增效率相關(guān),一般需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇探針。

    如果實(shí)驗(yàn)需要比較高濃度的引物,應(yīng)選擇非特探針(如: MassA);如果實(shí)驗(yàn)是需要檢測低濃度(例如1μg/μl、5μg/μl)的目標(biāo),則可選擇特探針。

    熒光定量 PCR的常用探針有:引物和探針類型是影響檢測結(jié)果的重要因素之一。

    不同的檢測方法對于每個步驟都有特殊要求,選擇適當(dāng)類型的引物和正確使用適宜濃度的探針對提高檢測結(jié)果是至關(guān)重要的。

    由于不同種類引物可能造成相同區(qū)域重復(fù)擴(kuò)增,因此應(yīng)盡可能用相同引物和相應(yīng)區(qū)域引物;在相同 PCR反應(yīng)條件下,選擇較合適、較穩(wěn)定且易于保存和使用的引物會得到擴(kuò)增效果;在相同 PCR條件下,也可以選擇較穩(wěn)定且容易獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的引物-金標(biāo)準(zhǔn)探針,但應(yīng)注意該引物并不能保證一定在擴(kuò)增反應(yīng)中得到結(jié)果。

    三、檢測試劑盒對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度

    首先要明確檢測試劑盒對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,一般情況下:

    如果實(shí)驗(yàn)需要,則需要先用試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。

    在實(shí)驗(yàn)過程中,由于使用的試劑較多,可能會出現(xiàn)假陰性情況(即未擴(kuò)增出核酸)。

    由于 PCR檢測的靈敏度和特都很高,對于假陽性結(jié)果應(yīng)立即做其他檢查。如果是特殊情況,如:臨床樣本檢測不到核酸時,可以先使用試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。

    最后一個問題:實(shí)驗(yàn)室空間的問題。

    四、檢測樣品的保存條件

    PCR擴(kuò)增所需的較適溫度為37℃,在低溫下,擴(kuò)增效率會明顯降低。

    此外還需要注意的是:溫度越高,擴(kuò)增效率越低。

    PCR擴(kuò)增反應(yīng)需要2-4℃或4-8℃的相對低溫環(huán)境中進(jìn)行,所以 PCR檢測室要保證環(huán)境溫度在15-30℃。

    由于實(shí)驗(yàn)所用液體一般都是有一定粘度和流動性的樣品,為了避免核酸變性、減少樣品變性、降低試劑成本等原因,需要對核酸進(jìn)行保護(hù)(加入 DMSO)以及對核酸進(jìn)行預(yù)變性以減少變性后引起的假陽性結(jié)果。

    1、 DMSO是將反應(yīng)體系中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%濃度的 DMSO作為保護(hù)劑,其可防止 DNA及 RNA在反應(yīng)中變性和降解;

    2、預(yù)變性是指將反應(yīng)體系中的樣品進(jìn)行適當(dāng)緩沖溶液處理以防止樣品變性,從而提高 PCR擴(kuò)增效率。預(yù)變性步驟一般可在2-8℃進(jìn)行。

    五、試劑、樣本前處理與后處理

    常用的試劑包括:

    DNA/RNA (通用試劑):常用的 DNA擴(kuò)增試劑,例如 Taq酶酶切探針、 dNTP裂解探針等。

    酶:酶法 PCR的擴(kuò)增效率取決于所用的酶種類及濃度,因此在擴(kuò)增過程中可能需要更換不同的酶。

    其他試劑:常規(guī) PCR使用的核酸提取、檢測所需引物,引物及探針等均需要進(jìn)行制備與優(yōu)化; PCR所需核酸片段(探針),如 DNA片段、DNA-RNA等也需要進(jìn)行后處理,以保證在 PCR擴(kuò)增過程中能夠達(dá)到要求。

    常見實(shí)驗(yàn)樣品有血細(xì)胞(血小板等)、腦脊液(細(xì)胞和組織)、血清(白蛋白等)及各種生物組織(肌肉和結(jié)締組織等)。

    常見實(shí)驗(yàn)項目有血清分析:血清蛋白定量檢測、抗體定量檢測和全血分析;細(xì)胞分析:組織活檢和細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn);生物樣本:基因芯片研究與分析。

    六、核酸提取方法與步驟(包括但不限于提取 DNA等)

    提取核酸需要先將基因組 DNA溶解,然后再進(jìn)行下一步處理。

    目前常用的方法有以下幾種:

    1、核酸酶法:利用特酶切反應(yīng),將核酸直接從 DNA模板上切割下來,得到目標(biāo)產(chǎn)物。常見的有 Taq酶、 DNA聚合酶、 RNase。

    2、核酸雜交法:利用特雜交反應(yīng),將目的基因轉(zhuǎn)化到靶基因的表達(dá)上去;

    3、原位雜交法:利用組織、細(xì)胞或其他微生物的 DNA作為探針,在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位檢測;

    4、毛細(xì)管電泳法:利用毛細(xì)管電泳和核酸擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合,對靶組織和細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

    以上都是針對傳統(tǒng)方法存在的問題, PCR實(shí)驗(yàn)室檢測可以根據(jù)實(shí)際情況使用相應(yīng)的方法,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    七、檢測儀器與設(shè)備

    PCR檢測儀器與設(shè)備主要有以下幾種:

    全自動恒溫擴(kuò)增儀:

    實(shí)時熒光定量 PCR儀:

    熒光分光光度計:

    電子擴(kuò)增儀或毛細(xì)管電泳式自動進(jìn)樣器,具有擴(kuò)增效率高、反應(yīng)時間短和檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

    液相色譜儀:

    液相色譜是一種專門用于分離提純和質(zhì)量控制的小型分析儀器,具有檢測靈敏度高、線性范圍寬、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。


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