浙江舟山電子潔凈廠房檢測第三方機構

時間：2023-01-02

作者：山東中安生物安全檢測有限公司

PCR實驗室是指能在短時間內擴增出目的基因片段的生物工程技術，應用于病毒檢測、病原體快速鑒定、個體識別、遺傳診斷及基因等領域。

在此次中， PCR實驗室主要應用的技術包括：病毒全基因組擴增與測序、核酸雜交技術與熒光原位雜交技術等。

下面是關于 PCR實驗室檢測的相關內容，希望能對您有所幫助。

PCR實驗室檢測可分為：樣本前處理和樣本后處理兩個部分：

本文主要介紹樣本前處理中的 PCR實驗室檢測，如有需要也可查看參考文獻或咨詢相關專業(yè)人士。

由于試劑盒等不能保證完全覆蓋實驗結果，我們需要根據實際情況做一些針對性處理，如：核酸擴增的條件是否合適、實驗試劑對實驗結果影響程度、實驗室人員技術水平以及實驗室空間等因素都會影響實驗結果。

一、PCR擴增條件

1.水： PCR擴增的過程中，由于核酸濃度高，需要大量清水，一般采用無菌水進行稀釋到10-50 mg/mL范圍內；

2.電泳主要是通過施加電壓讓 DNA聚合酶與模板進行化學結合，在一定時間內將模板復制出來；

3.引物的種類、濃度以及長度對 PCR結果有很大影響；

4.模板： PCR擴增反應的結果受模板的影響比較大，因此 PCR實驗室應建立自己的模板庫。

5. Taq酶：如果實驗用 Taq酶進行擴增，需根據 DNA反應體系選擇適當的 Taq酶；

6.擴增產物的分析： PCR實驗室擴增產物可通過質譜檢測（LC-MS/MS）。

二、試劑的選擇

實驗中常用的試劑有： DNA凝膠電泳試劑（如： PAGE、SDS-PAGE、 SV或SPE-PCR等）和熒光定量 PCR試劑（如 MassA等）。

DNA凝膠電泳和熒光定量 PCR所用探針的選擇與其擴增效率相關，一般需根據實驗目的來選擇探針。

如果實驗需要比較高濃度的引物，應選擇非特探針（如： MassA）；如果實驗是需要檢測低濃度（例如1μg/μl、5μg/μl）的目標，則可選擇特探針。

熒光定量 PCR的常用探針有：引物和探針類型是影響檢測結果的重要因素之一。

不同的檢測方法對于每個步驟都有特殊要求，選擇適當類型的引物和正確使用適宜濃度的探針對提高檢測結果是至關重要的。

由于不同種類引物可能造成相同區(qū)域重復擴增，因此應盡可能用相同引物和相應區(qū)域引物；在相同 PCR反應條件下，選擇較合適、較穩(wěn)定且易于保存和使用的引物會得到擴增效果；在相同 PCR條件下，也可以選擇較穩(wěn)定且容易獲得擴增產物的引物-金標準探針，但應注意該引物并不能保證一定在擴增反應中得到結果。

三、檢測試劑盒對實驗結果的影響程度

首先要明確檢測試劑盒對實驗結果的影響，一般情況下：

如果實驗需要，則需要先用試劑盒進行確認。

在實驗過程中，由于使用的試劑較多，可能會出現(xiàn)假陰性情況（即未擴增出核酸）。

由于 PCR檢測的靈敏度和特都很高，對于假陽性結果應立即做其他檢查。如果是特殊情況，如：臨床樣本檢測不到核酸時，可以先使用試劑盒進行確認。

最后一個問題：實驗室空間的問題。

四、檢測樣品的保存條件

PCR擴增所需的較適溫度為37℃，在低溫下，擴增效率會明顯降低。

此外還需要注意的是：溫度越高，擴增效率越低。

PCR擴增反應需要2-4℃或4-8℃的相對低溫環(huán)境中進行，所以 PCR檢測室要保證環(huán)境溫度在15-30℃。

由于實驗所用液體一般都是有一定粘度和流動性的樣品，為了避免核酸變性、減少樣品變性、降低試劑成本等原因，需要對核酸進行保護（加入 DMSO）以及對核酸進行預變性以減少變性后引起的假陽性結果。

1、 DMSO是將反應體系中加入質量分數為0.1%濃度的 DMSO作為保護劑，其可防止 DNA及 RNA在反應中變性和降解；

2、預變性是指將反應體系中的樣品進行適當緩沖溶液處理以防止樣品變性，從而提高 PCR擴增效率。預變性步驟一般可在2-8℃進行。

五、試劑、樣本前處理與后處理

常用的試劑包括：

DNA/RNA （通用試劑）：常用的 DNA擴增試劑，例如 Taq酶酶切探針、 dNTP裂解探針等。

酶：酶法 PCR的擴增效率取決于所用的酶種類及濃度，因此在擴增過程中可能需要更換不同的酶。

其他試劑：常規(guī) PCR使用的核酸提取、檢測所需引物，引物及探針等均需要進行制備與優(yōu)化； PCR所需核酸片段（探針），如 DNA片段、DNA-RNA等也需要進行后處理，以保證在 PCR擴增過程中能夠達到要求。

常見實驗樣品有血細胞（血小板等）、腦脊液（細胞和組織）、血清（白蛋白等）及各種生物組織（肌肉和結締組織等）。

常見實驗項目有血清分析：血清蛋白定量檢測、抗體定量檢測和全血分析；細胞分析：組織活檢和細胞學檢驗；生物樣本：基因芯片研究與分析。

六、核酸提取方法與步驟（包括但不限于提取 DNA等）

提取核酸需要先將基因組 DNA溶解，然后再進行下一步處理。

目前常用的方法有以下幾種：

1、核酸酶法：利用特酶切反應，將核酸直接從 DNA模板上切割下來，得到目標產物。常見的有 Taq酶、 DNA聚合酶、 RNase。

2、核酸雜交法：利用特雜交反應，將目的基因轉化到靶基因的表達上去；

3、原位雜交法：利用組織、細胞或其他微生物的 DNA作為探針，在靶細胞內進行原位檢測；

4、毛細管電泳法：利用毛細管電泳和核酸擴增反應相結合，對靶組織和細胞進行標記。

以上都是針對傳統(tǒng)方法存在的問題， PCR實驗室檢測可以根據實際情況使用相應的方法，提高檢測結果的準確性。

七、檢測儀器與設備

PCR檢測儀器與設備主要有以下幾種：

全自動恒溫擴增儀：

實時熒光定量 PCR儀：

熒光分光光度計：

電子擴增儀或毛細管電泳式自動進樣器，具有擴增效率高、反應時間短和檢測范圍廣等優(yōu)點。

液相色譜儀：

液相色譜是一種專門用于分離提純和質量控制的小型分析儀器，具有檢測靈敏度高、線性范圍寬、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

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