福建廈門獸藥車間GMP檢測(cè)第三方機(jī)構(gòu)

時(shí)間：2023-01-04作者：山東中安生物安全檢測(cè)有限公司瀏覽：61

PCR實(shí)驗(yàn)室是指能在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出目的基因片段的生物工程技術(shù)，應(yīng)用于病毒檢測(cè)、病原體快速鑒定、個(gè)體識(shí)別、遺傳診斷及基因等領(lǐng)域。

在此次中， PCR實(shí)驗(yàn)室主要應(yīng)用的技術(shù)包括：病毒全基因組擴(kuò)增與測(cè)序、核酸雜交技術(shù)與熒光原位雜交技術(shù)等。

下面是關(guān)于 PCR實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的相關(guān)內(nèi)容，希望能對(duì)您有所幫助。

PCR實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可分為：樣本前處理和樣本后處理兩個(gè)部分：

本文主要介紹樣本前處理中的 PCR實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如有需要也可查看參考文獻(xiàn)或咨詢相關(guān)專業(yè)人士。

由于試劑盒等不能保證完全覆蓋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們需要根據(jù)實(shí)際情況做一些針對(duì)性處理，如：核酸擴(kuò)增的條件是否合適、實(shí)驗(yàn)試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響程度、實(shí)驗(yàn)室人員技術(shù)水平以及實(shí)驗(yàn)室空間等因素都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

一、PCR擴(kuò)增條件

1.水： PCR擴(kuò)增的過程中，由于核酸濃度高，需要大量清水，一般采用無菌水進(jìn)行稀釋到10-50 mg/mL范圍內(nèi)；

2.電泳主要是通過施加電壓讓 DNA聚合酶與模板進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，在一定時(shí)間內(nèi)將模板復(fù)制出來；

3.引物的種類、濃度以及長(zhǎng)度對(duì) PCR結(jié)果有很大影響；

4.模板： PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果受模板的影響比較大，因此 PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的模板庫(kù)。

5. Taq酶：如果實(shí)驗(yàn)用 Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，需根據(jù) DNA反應(yīng)體系選擇適當(dāng)?shù)?Taq酶；

6.擴(kuò)增產(chǎn)物的分析： PCR實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物可通過質(zhì)譜檢測(cè)（LC-MS/MS）。

二、試劑的選擇

實(shí)驗(yàn)中常用的試劑有： DNA凝膠電泳試劑（如： PAGE、SDS-PAGE、 SV或SPE-PCR等）和熒光定量 PCR試劑（如 MassA等）。

DNA凝膠電泳和熒光定量 PCR所用探針的選擇與其擴(kuò)增效率相關(guān)，一般需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇探針。

如果實(shí)驗(yàn)需要比較高濃度的引物，應(yīng)選擇非特探針（如： MassA）；如果實(shí)驗(yàn)是需要檢測(cè)低濃度（例如1μg/μl、5μg/μl）的目標(biāo)，則可選擇特探針。

熒光定量 PCR的常用探針有：引物和探針類型是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素之一。

不同的檢測(cè)方法對(duì)于每個(gè)步驟都有特殊要求，選擇適當(dāng)類型的引物和正確使用適宜濃度的探針對(duì)提高檢測(cè)結(jié)果是至關(guān)重要的。

由于不同種類引物可能造成相同區(qū)域重復(fù)擴(kuò)增，因此應(yīng)盡可能用相同引物和相應(yīng)區(qū)域引物；在相同 PCR反應(yīng)條件下，選擇較合適、較穩(wěn)定且易于保存和使用的引物會(huì)得到擴(kuò)增效果；在相同 PCR條件下，也可以選擇較穩(wěn)定且容易獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的引物-金標(biāo)準(zhǔn)探針，但應(yīng)注意該引物并不能保證一定在擴(kuò)增反應(yīng)中得到結(jié)果。

三、檢測(cè)試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度

首先要明確檢測(cè)試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，一般情況下：

如果實(shí)驗(yàn)需要，則需要先用試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。

在實(shí)驗(yàn)過程中，由于使用的試劑較多，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性情況（即未擴(kuò)增出核酸）。

由于 PCR檢測(cè)的靈敏度和特都很高，對(duì)于假陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)立即做其他檢查。如果是特殊情況，如：臨床樣本檢測(cè)不到核酸時(shí)，可以先使用試劑盒進(jìn)行確認(rèn)。

最后一個(gè)問題：實(shí)驗(yàn)室空間的問題。

四、檢測(cè)樣品的保存條件

PCR擴(kuò)增所需的較適溫度為37℃，在低溫下，擴(kuò)增效率會(huì)明顯降低。

此外還需要注意的是：溫度越高，擴(kuò)增效率越低。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)需要2-4℃或4-8℃的相對(duì)低溫環(huán)境中進(jìn)行，所以 PCR檢測(cè)室要保證環(huán)境溫度在15-30℃。

由于實(shí)驗(yàn)所用液體一般都是有一定粘度和流動(dòng)性的樣品，為了避免核酸變性、減少樣品變性、降低試劑成本等原因，需要對(duì)核酸進(jìn)行保護(hù)（加入 DMSO）以及對(duì)核酸進(jìn)行預(yù)變性以減少變性后引起的假陽(yáng)性結(jié)果。

1、 DMSO是將反應(yīng)體系中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%濃度的 DMSO作為保護(hù)劑，其可防止 DNA及 RNA在反應(yīng)中變性和降解；

2、預(yù)變性是指將反應(yīng)體系中的樣品進(jìn)行適當(dāng)緩沖溶液處理以防止樣品變性，從而提高 PCR擴(kuò)增效率。預(yù)變性步驟一般可在2-8℃進(jìn)行。

五、試劑、樣本前處理與后處理

常用的試劑包括：

DNA/RNA （通用試劑）：常用的 DNA擴(kuò)增試劑，例如 Taq酶酶切探針、 dNTP裂解探針等。

酶：酶法 PCR的擴(kuò)增效率取決于所用的酶種類及濃度，因此在擴(kuò)增過程中可能需要更換不同的酶。

其他試劑：常規(guī) PCR使用的核酸提取、檢測(cè)所需引物，引物及探針等均需要進(jìn)行制備與優(yōu)化； PCR所需核酸片段（探針），如 DNA片段、DNA-RNA等也需要進(jìn)行后處理，以保證在 PCR擴(kuò)增過程中能夠達(dá)到要求。

常見實(shí)驗(yàn)樣品有血細(xì)胞（血小板等）、腦脊液（細(xì)胞和組織）、血清（白蛋白等）及各種生物組織（肌肉和結(jié)締組織等）。

常見實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有血清分析：血清蛋白定量檢測(cè)、抗體定量檢測(cè)和全血分析；細(xì)胞分析：組織活檢和細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)；生物樣本：基因芯片研究與分析。

六、核酸提取方法與步驟（包括但不限于提取 DNA等）

提取核酸需要先將基因組 DNA溶解，然后再進(jìn)行下一步處理。

目前常用的方法有以下幾種：

1、核酸酶法：利用特酶切反應(yīng)，將核酸直接從 DNA模板上切割下來，得到目標(biāo)產(chǎn)物。常見的有 Taq酶、 DNA聚合酶、 RNase。

2、核酸雜交法：利用特雜交反應(yīng)，將目的基因轉(zhuǎn)化到靶基因的表達(dá)上去；

3、原位雜交法：利用組織、細(xì)胞或其他微生物的 DNA作為探針，在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位檢測(cè)；

4、毛細(xì)管電泳法：利用毛細(xì)管電泳和核酸擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合，對(duì)靶組織和細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

以上都是針對(duì)傳統(tǒng)方法存在的問題， PCR實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以根據(jù)實(shí)際情況使用相應(yīng)的方法，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

七、檢測(cè)儀器與設(shè)備

PCR檢測(cè)儀器與設(shè)備主要有以下幾種：

全自動(dòng)恒溫?cái)U(kuò)增儀：

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀：

熒光分光光度計(jì)：

電子擴(kuò)增儀或毛細(xì)管電泳式自動(dòng)進(jìn)樣器，具有擴(kuò)增效率高、反應(yīng)時(shí)間短和檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

液相色譜儀：

液相色譜是一種專門用于分離提純和質(zhì)量控制的小型分析儀器，具有檢測(cè)靈敏度高、線性范圍寬、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。


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