海藻糖對(duì)枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化研究

時(shí)間：2024-11-14作者：威尼德生物科技(北京)有限公司瀏覽：269

一、引言

 

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種革蘭氏陽(yáng)性菌，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。它具有非致病性、分泌蛋白能力強(qiáng)、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)酶、抗生素和其他生物活性物質(zhì)的重要宿主菌。然而，其電轉(zhuǎn)化效率較低一直是限制其基因工程操作的關(guān)鍵因素之一。

 

電轉(zhuǎn)化是將外源 DNA 導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的一種重要方法。在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞膜在高壓電場(chǎng)作用下形成臨時(shí)性的孔道，使外源 DNA 能夠進(jìn)入細(xì)胞。但這個(gè)過(guò)程對(duì)細(xì)胞造成的損傷往往較大，影響細(xì)胞的存活率和轉(zhuǎn)化效率。海藻糖是一種**的非還原性二糖，已被證明在多種生物體系中具有保護(hù)細(xì)胞免受各種脅迫的作用，如干旱、高溫和冷凍等。在微生物電轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，海藻糖可能通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成等機(jī)制來(lái)提高細(xì)胞在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中的存活率和轉(zhuǎn)化效率。因此，本研究旨在探索海藻糖對(duì)枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化，以期為枯草芽孢桿菌的基因工程改造提供較有效的手段。

 

二、材料與方法

 

（一）菌株和質(zhì)粒

 

枯草芽孢桿菌菌株 [具體菌株編號(hào)] 為本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體質(zhì)粒 [質(zhì)粒名稱]，攜帶 [具體抗性基因和目的基因等相關(guān)信息]。

 

（二）培養(yǎng)基和試劑

 

1. 培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，其配方為：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。固體培養(yǎng)基添加 1.5% 的瓊脂粉。

2. 試劑
高純度海藻糖（分析純），電轉(zhuǎn)緩沖液（[具體配方成分和濃度]），其他常規(guī)化學(xué)試劑如氯化鈣、乙醇等均為分析純。

 

（三）細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理

 

從 - 80℃甘油保存的枯草芽孢桿菌甘油菌中挑取單菌落接種于 5ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

取 1ml 過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至 100ml 新鮮 LB 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至 OD???達(dá)到 0.6 - 0.8。

將培養(yǎng)好的菌液在冰上放置 10 分鐘，然后 4℃、5000rpm 離心 10 分鐘收集菌體。

用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌菌體兩次，最后將菌體重懸于適量體積的電轉(zhuǎn)緩沖液中，使細(xì)胞濃度達(dá)到 [具體濃度值]。

 

（四）海藻糖處理

 

在重懸后的細(xì)胞懸液中分別加入不同終濃度的海藻糖（0、50mM、100mM、150mM、200mM），充分混勻后在冰上孵育 30 分鐘。

 

（五）電轉(zhuǎn)化操作

 

將處理好的細(xì)胞與 1μg 純化的質(zhì)粒 DNA 混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中（電極間距為 0.2cm）。

使用電轉(zhuǎn)化儀（[電轉(zhuǎn)化儀型號(hào)]）進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，設(shè)置不同的電壓（1000V、1250V、1500V、1750V、2000V）和電容（25μF），脈沖時(shí)間固定為 5ms。

電轉(zhuǎn)化結(jié)束后，立即加入 1ml 預(yù)冷的復(fù)蘇培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基添加 0.5M 山梨醇），轉(zhuǎn)移至 1.5ml 離心管中，37℃、100rpm 振蕩復(fù)蘇 2 小時(shí)。

 

（六）轉(zhuǎn)化子篩選與計(jì)數(shù)

 

取適量復(fù)蘇后的菌液涂布于含有相應(yīng)抗生素（根據(jù)質(zhì)粒攜帶抗性基因選擇）的 LB 固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化子數(shù) /μg DNA）。同時(shí)，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定未加質(zhì)粒 DNA 的細(xì)胞在電轉(zhuǎn)化后的存活率，以評(píng)估海藻糖對(duì)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中損傷的保護(hù)作用。

 

三、結(jié)果

 

（一）海藻糖濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響

 

在不同電壓下，未添加海藻糖的細(xì)胞在電轉(zhuǎn)化后的存活率較低。隨著海藻糖濃度的增加，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在 100 - 150mM 海藻糖濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率在各電壓下均達(dá)到較高水平。例如，在 150mM 海藻糖和 1500V 電壓條件下，細(xì)胞存活率比未添加海藻糖時(shí)提高了約 [X]%。

 

（二）海藻糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

 

不同電壓下，海藻糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。在較低電壓（1000 - 1250V）下，低濃度（50mM）海藻糖對(duì)轉(zhuǎn)化效率有一定的提高作用，但效果不明顯。隨著電壓升高，100 - 150mM 海藻糖濃度可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。在 1500V 和 150mM 海藻糖條件下，轉(zhuǎn)化效率比未添加海藻糖時(shí)提高了約 [Y] 倍。

當(dāng)海藻糖濃度過(guò)高（200mM）時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而下降，可能是由于高濃度海藻糖對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)產(chǎn)生了負(fù)面影響，如滲透壓改變等。

 

（三）電壓對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

 

在相同海藻糖濃度下，電壓對(duì)轉(zhuǎn)化效率也有重要影響。較低電壓下，細(xì)胞膜形成的孔道不足以使足夠量的 DNA 進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低。隨著電壓升高，轉(zhuǎn)化效率增加，但過(guò)高的電壓（2000V）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，使轉(zhuǎn)化效率下降。在 150mM 海藻糖存在下，1500 - 1750V 電壓范圍內(nèi)可獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。

 

四、討論

 

（一）海藻糖提高細(xì)胞存活率的機(jī)制

 

海藻糖可能通過(guò)多種機(jī)制提高枯草芽孢桿菌在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中的存活率。一方面，海藻糖可以與細(xì)胞膜磷脂雙分子層相互作用，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少高壓電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜的破壞。在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞膜受到高強(qiáng)度電場(chǎng)的作用，磷脂雙分子層的排列容易紊亂，海藻糖的存在可以在一定程度上維持細(xì)胞膜的完整性。另一方面，海藻糖可能作為一種細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)劑，減少細(xì)胞內(nèi)水分在電脈沖過(guò)程中的重排和冰晶形成，從而降低對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和生物大分子的損傷。

 

（二）海藻糖提高轉(zhuǎn)化效率的原因

 

由于海藻糖提高了細(xì)胞存活率，使得更多的細(xì)胞在電轉(zhuǎn)化后能夠存活并進(jìn)行后續(xù)的基因表達(dá)和復(fù)制過(guò)程，從而增加了轉(zhuǎn)化子的數(shù)量。存活的細(xì)胞有更多的機(jī)會(huì)攝取和整合外源 DNA，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化效率。

 

海藻糖可能影響細(xì)胞膜在電脈沖后的恢復(fù)過(guò)程，使得細(xì)胞膜孔道在合適的時(shí)間內(nèi)保持開放狀態(tài)，有利于外源 DNA 的進(jìn)入。同時(shí)，海藻糖可能與 DNA 分子有一定的相互作用，促進(jìn) DNA 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定存在和整合，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率。

 

（三）較佳條件的選擇

 

綜合考慮細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)化效率，150mM 海藻糖和 1500 - 1750V 電壓是本研究中枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化的較優(yōu)條件。在這個(gè)條件下，能夠在保證較高細(xì)胞存活率的同時(shí)獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。這個(gè)優(yōu)化后的方法為枯草芽孢桿菌的基因工程操作提供了較有效的途徑，例如在構(gòu)建基因文庫(kù)、表達(dá)外源蛋白等方面具有重要應(yīng)用**。

 

五、結(jié)論

 

本研究通過(guò)系統(tǒng)地研究海藻糖濃度和電轉(zhuǎn)化電壓對(duì)枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化的影響，成功優(yōu)化了枯草芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化方法。合適濃度的海藻糖能夠顯著提高細(xì)胞在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中的存活率和轉(zhuǎn)化效率，較佳條件為 150mM 海藻糖和 1500 - 1750V 電壓。這種優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)化方法將有助于推動(dòng)枯草芽孢桿菌在生物技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用，為后續(xù)的基因工程研究和工業(yè)生產(chǎn)提供有力支持。同時(shí)，本研究也為其他微生物電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化提供了一定的參考，尤其是對(duì)于那些對(duì)電轉(zhuǎn)化敏感、轉(zhuǎn)化效率低的微生物，探索類似的保護(hù)劑和優(yōu)化條件可能具有重要意義。

 

在未來(lái)的研究中，可以進(jìn)一步深入研究海藻糖與枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)其他成分在電轉(zhuǎn)化過(guò)程中的相互作用機(jī)制，以及探索其他可能的添加劑或處理方法來(lái)進(jìn)一步提高電轉(zhuǎn)化效率。此外，將優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用于較復(fù)雜的基因工程操作，如多基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建等，也是值得探索的方向。


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