如何防止PCR實驗室污染？

時間：2017-07-18作者：北京迎海東旭實驗室設(shè)備有限公司瀏覽：62

一、PCR實驗室污染主要是下面四個方面
       1、標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。   
      2、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。   
      3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中較主要較常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)**PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以較微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。   
      4、還有一種容易忽視，較可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。   
      5、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見，因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。  
二、污染的監(jiān)測   
      一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。    
1、對照試驗   
      1）陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。陽性 對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大.因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。   
     2）陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標(biāo)本對照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測試劑是否污染。   
     3）重復(fù)性試驗   
     4）選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增     
三、防止污染的方法   
     試驗人員在PCR操作時，注意遵守PCR操作規(guī)范，降低污染的出現(xiàn)。
1、劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)*閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：   
       1）試劑準(zhǔn)備區(qū)。   
       2）標(biāo)本制備區(qū)。   
       3）PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。   
各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材**，要有一定的方向性。如：試劑準(zhǔn)備→標(biāo)準(zhǔn)制備→PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。   
切記：任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。   
2 . 分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的**凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA：   
        1）PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；   
        2）引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；   
        3）引物和dNTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標(biāo)明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。    
3 . 實驗操作注意事項   
盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：   
      1）戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；   
      2）使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；   
      3）避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；   
      4）操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的**度；   
      5）最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；   
      6）操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的**性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；   
      7）盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器較容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，較好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該**，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；   
      8）重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。


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