欣諭儀器：耐熱凍干保護(hù)劑在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

時(shí)間：2013-03-28作者：上海欣諭儀器有限公司瀏覽：217

凍干保護(hù)劑可影響生物制品的質(zhì)量、效價(jià)和穩(wěn)定性，改變生物制品的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品干燥能力并增大產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性。耐熱凍干保護(hù)劑有*活性但無藥理活性，可在凍干和保存時(shí)維持疫苗的穩(wěn)定性，初次干燥時(shí)在適宜的溫度下疫苗不倒塌，企業(yè)低成本即可獲取。

一、分類

      （一）按相對(duì)分子量分

       按相對(duì)分子量分可分為低分子化合物和高分子化合物。

   1.低分子化合物   低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一懸液，起到水分緩解作用。如：

       酸性物質(zhì)：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸；

       中性物質(zhì)：葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇；

       堿性物質(zhì)：精氨酸、組氨酸。

   2.高分子化合物   高分子化合物對(duì)微生物有保護(hù)作用，可促進(jìn)其升華形成耐熱骨架阻斷熱傳導(dǎo)和熱輻射。如：白蛋白、明膠、蛋白胨、脫脂奶粉。

    水解明膠   水解明膠可去掉雜質(zhì)蛋白、無抗原性、無過敏反應(yīng)、無熱源，并且分子量小、均質(zhì)、易溶于水，可過濾除菌，共熔點(diǎn)為-12℃。對(duì)微生物的保護(hù)作用高出普通明膠10％以上。

脫脂奶粉  可促進(jìn)升華、加熱滅菌，易**均質(zhì)產(chǎn)品，并擴(kuò)大細(xì)胞相互間的距離。

 (二)按功能和性質(zhì)分

1.耐熱凍干保護(hù)劑   耐熱凍干保護(hù)劑在凍結(jié)和干燥過程中，可防止活性組分變性，如海藻糖、蔗糖、聚維酮（PVP）等。

2.填充劑  可防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，如：甘露醇、明膠等。

3.抗氧化劑  產(chǎn)品的自身氧化可消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧；放入電子或氫離子，可阻斷凍干樣品中氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制氧化酶活性，防止樣品在冷凍干燥及儲(chǔ)藏過程中氧化變質(zhì)。如硫代硫酸鈉、維生素E、維生素C等。

4.酸堿調(diào)整劑  在冷凍干燥、儲(chǔ)藏過程中，將生物制品PH值調(diào)整到活性物質(zhì)較穩(wěn)定區(qū)域。常用的有：磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉。

（三）按物質(zhì)的種類分本報(bào)道來自欣諭儀器

1.糖/多元醇類  單糖（葡萄糖、半乳糖）： 糖與生物制品活性組分的分子形成氫鍵而代替了原有水的位置，起保護(hù)作用；

低聚糖（蔗糖、海藻糖）：低聚糖能起到低溫保護(hù)功能和脫水保護(hù)作用；海藻糖則具有相對(duì)較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。海藻糖—蛋白質(zhì)—水微冰晶的形成，有效防止了水對(duì)玻璃化態(tài)的增塑作用。并且其內(nèi)部氫鍵較少，有利于蛋白質(zhì)分子間形成氫鍵。

多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）:多元醇具有和糖一樣的作用。甘露醇無菌濾液穩(wěn)定，不易被氧化，可提供支持結(jié)構(gòu)，并且不與活性組分發(fā)生反應(yīng)；山梨醇是甘露醇的同分異構(gòu)體，但其溶解度比甘露醇大，在常溫下呈粘稠的透明狀液體，有旋光性，略有甜味，具有吸濕性，高溫下不穩(wěn)定，在冷凍干燥配方中，山梨醇常用作填充劑。

2.表面活性劑類  表面活性劑是降低界面的張力，親水、親油基組成的化合物。表面活性劑可分為離子型、非離子型。凡是溶于水能電離成離子的，稱為離子型表面活性劑，否則稱為非離子型表面活性劑。表面活性劑在凍結(jié)和脫水過程中既能降低冰、水界面張力所引起的凍結(jié)和脫水變形，又能在復(fù)水過程中對(duì)活性組分起到潤(rùn)濕劑作用。但在凍干生物制品測(cè)定和長(zhǎng)期儲(chǔ)藏中，表面活性劑并沒有保護(hù)作用。

3.氨基酸類   氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，其中較主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸類保護(hù)劑有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和組氨酸，試驗(yàn)表明氨基酸是較好的填充劑。

低濃度甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致PH值的改變而阻止蛋白質(zhì)藥物變性，并且能升高成品的塌陷（崩解）溫度，阻止因塌陷而引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。

4.其它添加劑類  其它添加劑類保護(hù)劑包括抗氧化劑、緩沖劑和凍干加速劑。

抗氧化劑：一種是抗氧化劑的自身氧化，消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧，使凍干樣品物料不被氧化；另一種使抗氧化劑給出電子或氫離子，阻斷凍干樣品中的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；還有一種方式是抗氧化劑通過抑制氧化的活性而防止凍干樣品的氧化變質(zhì)，如維生素E、維生素C、硫代硫酸鈉、硫脲。

緩沖劑：蛋白質(zhì)具有兩性電解質(zhì)，既能和酸作用又能和堿作用。在中性環(huán)境中，大多數(shù)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，由于蛋白質(zhì)溶液在凍結(jié)過程中溶液的濃度是逐漸升高的，所以在高濃度時(shí)可改變?nèi)芤旱?span>PH值，PH值變化4個(gè)單位導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使生物制品失活。因此在凍干保護(hù)劑配方中，需添加適量緩沖劑。如，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉。

凍干加速劑：冷凍干燥過程耗時(shí)長(zhǎng)、耗能多，迫切需要對(duì)凍干循環(huán)進(jìn)行優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本。叔丁醇是一種小分子醇，與水完全互溶，具有低毒性、高蒸汽壓。在藥品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：

可降低干燥層阻力，從而加速干燥過程，縮短干燥時(shí)間；對(duì)于難溶于水的藥品，可使產(chǎn)品具有較高的比表面積、好的外觀，并易于復(fù)水，提高藥品溶液和凍干品的穩(wěn)定性，且有一定的抑菌作用。

二、凍干保護(hù)劑的作用機(jī)理

（一）凍結(jié)過程中低溫保護(hù)機(jī)理

“**作用”機(jī)理認(rèn)為，蛋白質(zhì)溶液在達(dá)到較大凍結(jié)濃度之前，**與水作用（**水合），而保護(hù)劑**被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（**排斥）。這是由于保護(hù)劑的加入，增大了水分子的表面張力，促使了蛋白質(zhì)分子**與水分子相互作用。在這種情況下，蛋白質(zhì)分子外表面比其體相中有相對(duì)較多的水分子和相對(duì)較少的保護(hù)劑分子，從而也就保護(hù)了蛋白質(zhì)的**構(gòu)象。

“**作用”機(jī)理并不能完全解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。因此，必然存在其他保護(hù)作用機(jī)理。表面張力減小的機(jī)理可以用于解釋表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)溶液凍結(jié)過程的保護(hù)。限制蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散的機(jī)理認(rèn)為，許多保護(hù)劑都能夠提高溶液的粘度，抑制活性分子的擴(kuò)散。

（二）干燥過程中的保護(hù)機(jī)理

玻璃態(tài)假說  在含有保護(hù)劑溶液的干燥過程中，當(dāng)濃度足夠大且保護(hù)劑不發(fā)生結(jié)晶時(shí)，保護(hù)劑與活性組分混合物就會(huì)形成玻璃態(tài)。玻璃態(tài)分為兩種即：強(qiáng)玻璃和弱玻璃。

在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以下進(jìn)行降溫，弱玻璃粘度的增加，比強(qiáng)玻璃來的快。因此，賦形劑形成弱玻璃要比形成強(qiáng)玻璃的保護(hù)效果好得多。蔗糖和海藻糖就是因?yàn)槟軌蛐纬梢环N弱玻璃而具有很好的保護(hù)作用。

水替代假說  由于蛋白質(zhì)分子中存在大量的氫鍵，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過程中推動(dòng)水分后，保護(hù)劑的羥基能夠替代蛋白質(zhì)表面上水的羥基，使蛋白質(zhì)表面形成一層“水合層”，這樣就可以保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，從而保持了蛋白質(zhì)**結(jié)構(gòu)和功能的完整性。當(dāng)冷凍干燥時(shí)，保護(hù)劑可與生物大分子的失水部位形成氫鍵，替代保持生物大分子凍干損傷。

（三）儲(chǔ)藏過程中的保護(hù)機(jī)理  

干燥過程中出現(xiàn)的引起蛋白質(zhì)變質(zhì)的時(shí)間尺度為小時(shí)，而對(duì)于儲(chǔ)藏而言，時(shí)間尺度為月或年。在正確的冷凍干燥工藝中，要求產(chǎn)品溫度接近于其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而在正確的儲(chǔ)藏條件下，環(huán)境溫度應(yīng)當(dāng)比其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低得多，以獲得很長(zhǎng)的松馳時(shí)間。

三、耐熱凍干保護(hù)劑配方需要注意的問題   

確定較優(yōu)的pH值   生物制品中的活性成分（如蛋白質(zhì)）只有在很小的PH值范圍內(nèi)才是穩(wěn)定的，并且不同的PH環(huán)境會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解性。較優(yōu)的PH環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和它在溶液中的溶解性，冷凍干燥配方的PH對(duì)凍干生物制品長(zhǎng)期儲(chǔ)藏的穩(wěn)定性也會(huì)帶來很大影響。另外，酸堿度會(huì)影響固體狀態(tài)下蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性。

緩沖劑的選擇   許多緩沖劑能夠用于生物制品耐熱保護(hù)劑配方中，但是并非每一種緩沖劑都能夠用于任何溶液；對(duì)PH值敏感的蛋白質(zhì)溶液，就應(yīng)當(dāng)避免使用磷酸鈉緩沖液，這是由于在凍結(jié)過程中，Na2HPO4易于**結(jié)晶，使得溶液的PH降低，較終引起蛋白質(zhì)變性；正確選擇緩沖劑的濃度也是很重要的。

填充劑的選擇   填充劑有相當(dāng)好的溶解性，與生物制品中活性組分相容，沒有或者只有很小的毒性，具有較高的共晶溫度。

低溫、干燥保護(hù)劑的選擇   糖類是生物制品冷凍干燥過程中使用較頻繁的保護(hù)劑，一般不選用還原性糖，因?yàn)樗赡芘c蛋白質(zhì)之間發(fā)生非酶褐變反應(yīng)；某些鹽類也要用作生物制品在冷凍干燥過程中的保護(hù)劑；某些聚合物，因其能提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而常被用作保護(hù)劑。但是，聚合物與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)**糖類，所以常常采用聚合物和糖聯(lián)合使用，當(dāng)然，這種方式并不是對(duì)每一種蛋白質(zhì)都是有效的。

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