平衡溶解度實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求

時間：2020-08-13作者：深圳市訊科標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司瀏覽：214

1 溶解度的概念

 

根據(jù)**純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)的定義，溶解度是飽和溶液在*溶劑中以*溶質(zhì)的比例表示的分析組成。溶解度可以用不同的濃度單位表示，如質(zhì)量摩爾濃度、摩爾分?jǐn)?shù)、摩爾比、質(zhì)量/體積比等。溶解度通常分為3種：

①動力學(xué)溶解度，表示當(dāng)溶液中剛開始出現(xiàn)沉淀時化合物的濃度；

②平衡溶解度，也稱為熱力學(xué)溶解度，表示飽和溶液中存在過量固體時，溶液和固體處于平衡狀態(tài)時化合物的濃度，是固體溶解和從溶液中析出的動態(tài)平衡過程；

③固有溶解度，是指離子型化合物在某個pH為完全非離子化的游離酸或游離堿時的平衡溶解度。

 

根據(jù)一般溶解度方程(GSE)，可以估算藥物在水中的固有溶解度(S0)(公式1)：logS0=－0.01(MP－25)－logKow+0.5(公式1)MP為熔點(diǎn)(℃)，Kow為油水分配系數(shù)。方程表明，具有較高熔點(diǎn)以及較高親油性化合物的水溶解性較低。

 

如果已知pKa，一般溶解度方程也可與Hender-son-Hasselbalch方程相結(jié)合來預(yù)測離子化合物的溶解度(公式2)：Stot=S0(1+10(pKb－pH)+10(pH－pKa))(公式2)Stot為溶質(zhì)總的溶解度，S0為固有溶解度，pKa為酸解離常數(shù)的負(fù)對數(shù)，pKb為堿解離常數(shù)的負(fù)對數(shù)。

 

目前有幾種計算軟件可以用于估算基于結(jié)構(gòu)的化合物油水分配系數(shù)和pKa值，但不足以取代平衡溶解度實(shí)驗(yàn)測定。

 

2 WHO平衡溶解度項(xiàng)目

 

WHO*40次技術(shù)報告“關(guān)于豁免WHO基本藥物目錄中口服固體速釋制劑體內(nèi)生物等效性研究的要求”一章的WHO基本藥物目錄中，列出了基本藥物的溶解性、滲透性、BCS分類及是否符合生物等效性豁免等。

 

WHO期望將其不斷較新作為一個動態(tài)文件放在官方網(wǎng)站上。2016年WHO藥品標(biāo)準(zhǔn)***(ECSPP)達(dá)成了一致，該目錄應(yīng)是基于驗(yàn)證過的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，而不是文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。

 

因此2018年WHO組織了一個新的多中心項(xiàng)目，**十余個國家實(shí)驗(yàn)室和大學(xué)參加，目的是測定WHO基本藥物目錄中原料藥的平衡溶解度，以確定藥物的BCS分類，判斷其是否可生物等效豁免。筆者接下來對WHO推薦的平衡溶解度實(shí)驗(yàn)的基本程序和技術(shù)要求進(jìn)行詳細(xì)闡述。

 

3 基本程序和技術(shù)要求

 

3.1基本原理

 

根據(jù)WHO*51次技術(shù)報告“多來源(仿制)藥品：建立可互換性注冊要求的指導(dǎo)原則”對溶解度的界定，當(dāng)藥物的較高單次**劑量在pH1.2～6.8內(nèi)溶解于250mL或較少的水介質(zhì)時，可視為高溶，其中較高單次**劑量是由有關(guān)監(jiān)管部門決定的，由批準(zhǔn)的標(biāo)簽或藥品說明書推薦。

 

藥物的pH-溶解度曲線應(yīng)在(37±1)℃水介質(zhì)中測定，每個pH條件下至少重復(fù)測定3次。一般采用平衡溶解度實(shí)驗(yàn)判斷藥物的溶解性，藥物首先溶解或懸浮在緩沖液中，用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x之后，測定溶液或上清液的濃度。測定前應(yīng)記錄藥物的來源和純度，有時也需要了解其他特性。

 

實(shí)驗(yàn)是在250mL體積中檢測較高單次**劑量，也可以考慮等比例縮小體積，特殊情況如藥物量不足，且價格昂貴，或當(dāng)用藥典緩沖液無法維持介質(zhì)的pH值時除外。儀器允許的情況下可采用小體積的溶解度介質(zhì)(比如50mL)。平衡溶解度的測定方法有許多種，如搖瓶法、酸堿滴定法或其他方法。

 

應(yīng)當(dāng)證明所用方法的合理性，并且有方法學(xué)數(shù)據(jù)的支持。WHO推薦的搖瓶法是基于40年前開發(fā)的相溶解度技術(shù)，至今仍被大多數(shù)人認(rèn)為是較可靠和較廣泛使用的溶解度測定方法。

 

搖瓶法是使用定軌搖床等機(jī)械振蕩裝置，應(yīng)能控制保持在(37±1)℃，并設(shè)置適當(dāng)?shù)恼袷幩俾剩捎眠m當(dāng)?shù)姆椒?yàn)證。振蕩速率應(yīng)根據(jù)燒瓶或試管的形狀以及溶液的體積進(jìn)行優(yōu)化，保證藥物顆粒充分接觸稀釋劑，防止顆粒聚集，并避免形成渦流。

 

在優(yōu)化好振蕩速率的情況下，一般樣品24h內(nèi)即達(dá)到平衡，也有的品種需要72h甚至較長時間，應(yīng)在幾個不同時間點(diǎn)驗(yàn)證樣品是否達(dá)到平衡。如果藥物的潤濕性較差，浮在溶解度介質(zhì)表面的話，可以借助玻璃微珠等工具通過攪拌或超聲使顆粒分散。一旦成功達(dá)到潤濕性，平衡溶解度實(shí)驗(yàn)會繼續(xù)走向平衡。

 

3.2用于平衡溶解度測定的緩沖液

 

pH-溶解度曲線應(yīng)在pH1.2～6.8內(nèi)測定，藥物的溶解度分類是根據(jù)上述pH值范圍內(nèi)的較低溶解度。根據(jù)研究的可變性，至少在pH1.2，4.5，6.8條件下平行測定3份以上，例如，0.1mol·L－1鹽酸溶液或pH1.2模擬無酶胃液，pH4.5乙酸緩沖液以及pH6.8磷酸緩沖液。

 

以藥物的離子化特性為依據(jù)來決定pH值的個數(shù)，如果已經(jīng)知道藥物在上述pH范圍內(nèi)水介質(zhì)中的較低溶解度(如pKa)，也需要測定在那個pH時的溶解度數(shù)值。在相同溫度下［如(37±1)℃］調(diào)節(jié)緩沖液的pH值。

 

當(dāng)藥物加入到作為溶劑的緩沖液中，此時溶劑的pH值需要用校準(zhǔn)過的pH計進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需要再次驗(yàn)證pH值。如果緩沖液與溶質(zhì)結(jié)合后pH發(fā)生了改變，可用適當(dāng)?shù)乃峄驂A溶液調(diào)節(jié)pH值，或者使用較強(qiáng)緩沖能力的緩沖液。

 

調(diào)節(jié)pH值后，緩沖液需要至少平衡1h后再加入樣品。WHO推薦的緩沖液配制方法如下，相關(guān)試劑的配制可查閱《**藥典》：pH1.2緩沖液:稱取2.52g氯化鈉，加入900mL水使溶解，用鹽酸溶液(約70g·L－1)調(diào)節(jié)pH值為1.2，再用水稀釋至1000mL。

 

pH4.5緩沖液:稱取2.99g乙酸鈉，加入900mL水使溶解，用醋酸溶液(約120g·L－1)約14mL調(diào)節(jié)pH值為4.5，再用水稀釋至1000mL。pH6.8緩沖液：稱取6.9g磷酸二氫鈉和0.9g**，加入800mL水，用**試液(約80g·L－1)調(diào)節(jié)pH值為6.8，再用水稀釋至1000mL。

 

3.3預(yù)實(shí)驗(yàn)

 

建議根據(jù)藥物特性進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步評估達(dá)到平衡的時間、預(yù)期溶解度以及關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)需要的樣品量。在5mL(或選定的體積)pH1.2，4.5和6.8緩沖液中加入過量30%～40%的固體，測定溶液中固體的量。

 

如果使用5mL緩沖液的話，可將固體加入10mL試管中。緩沖液體積的確定對應(yīng)于預(yù)期的較小溶解度，如果溶解度大于預(yù)期值，則將體積減小至3mL；如果預(yù)期溶解度低且樣品量足夠，則使用較高的體積。或者體積保持在5mL，通過增加或減少樣品量調(diào)整。

 

檢查是否有未溶解的固體；如果固體完全溶解至緩沖液中，應(yīng)向試管中添加額外的固體直至有固體保持不溶解的狀態(tài)為止。解決與固體潤濕性或聚集有關(guān)的任何潛在問題，可在試管中加入玻璃微珠后機(jī)械振搖或磁力攪拌。

 

制成飽和溶液后，每個pH至少制備3份樣品，在不同時間點(diǎn)取樣測定溶質(zhì)的溶解量。建議在約6個時間點(diǎn)(比如2，4，8，24，48，72h)測定溶液的濃度直至每次測定之間不再有顯著差異，以確定藥物達(dá)到平衡所需要的時間。

 

取出溶液后須立*濾樣品(如使用0.45μm濾膜)或離心分離未溶解的樣品，當(dāng)介質(zhì)體積小時建議采用過濾的分離方式，離心也是一種有效的替代方法。溶解度實(shí)驗(yàn)是在(37±1)℃條件下操作，如果分析測定之前需要將樣品在室溫下放置，則樣品離心或過濾后應(yīng)立即稀釋，以避免溶質(zhì)析出。

 

到達(dá)藥物濃度隨時間變化的平臺期所需的較短時間可認(rèn)為是合適的平衡時間。確定達(dá)到平衡的時間后，應(yīng)再次測定緩沖液的pH值。

 

3.4穩(wěn)定性

 

應(yīng)監(jiān)測藥物在pH范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，以測定真實(shí)的溶解度。如有收載的話，采用國內(nèi)外藥典確認(rèn)過的分析方法分析藥物及其降解產(chǎn)物，比如高效液相色譜法(HPLC)、分光光度法或其他確認(rèn)過的分析方法。

 

因HPLC可用于雜質(zhì)和不穩(wěn)定性的檢測，故與分光光度法相比，建議**選擇HPLC。應(yīng)當(dāng)關(guān)注緩沖液組成或pH是否會導(dǎo)致藥物的降解。如果沒有適合的穩(wěn)定性分析方法，則需要進(jìn)行單獨(dú)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以證明樣品在緩沖液介質(zhì)中是穩(wěn)定的。

 

3.5分析方法

 

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，較好使用5～6個濃度水平作線性回歸，估算截距、斜率和相關(guān)系數(shù)，使用另外3個控制濃度點(diǎn)獨(dú)立評估精密度和準(zhǔn)確度。如有必要，稀釋后的樣品應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，記錄稀釋因子進(jìn)行反算。

 

每份樣品進(jìn)2針并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。預(yù)計至少運(yùn)行3～4次分析(例如，首先是2，4，8h的樣品，然后可能還需要另外3次24，48和72h的樣品)，這取決于樣品的穩(wěn)定性。最后對數(shù)據(jù)進(jìn)行日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度的評估。一般情況下，控制濃度點(diǎn)和樣品是穿插進(jìn)樣的。

 

為了考察過濾的影響，控制濃度點(diǎn)可以在過濾前后分別進(jìn)樣?；厥章蕬?yīng)在98%～102%之間（ 如果小于這個值表明發(fā)生了濾膜吸附；如果大于這個值表明濾膜的成分在影響分析)。有必要的話可以更換過濾方式。評估專屬性，線性，范圍，準(zhǔn)確度，重復(fù)性和中間精密度，應(yīng)符合較低接受限度。

 

3.6關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)

 

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)。下列步驟是進(jìn)行關(guān)鍵溶解度實(shí)驗(yàn)的一般例子：

 

①每個pH條件需平行3份進(jìn)行評估，稱取約過量10%的樣品(通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)置燒瓶中，加入適當(dāng)體積的緩沖液(至少pH1.2，4.5，6.8緩沖液3種)；

②混勻后測定pH值；

③設(shè)置搖床的溫度和振蕩速率，把燒瓶放入搖床中固定；

④根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)評估的平衡時間，取出一部分懸浮溶液；

⑤立*濾或離心分離未溶解的樣品；

⑥記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)束時溶液的pH值；

⑦定量分析前盡快稀釋樣品，避免析出；

⑧測定藥物的濃度。

 

3.7結(jié)果報告

 

溶解度以mg·mL－1表示。每個實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)溶解度結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)不大于10%劑量-溶解度體積(DSV)表示在觀察到溶解度較低的pH條件下，完全溶解藥物的較高單次**劑量所需的溶液體積。DSV可以通過將藥物較高單次**劑量(mg)除以研究中測得的溶解(mg·mL－1)計算得到。當(dāng)DSV在整個pH1.2～6.8內(nèi)小于250mL時，藥物被認(rèn)為是高溶。

 

4 影響溶解度的因素

 

藥物的溶解度不僅受藥物的比表面積、粒度、晶型等物理化學(xué)性質(zhì)的影響，還受介質(zhì)的性質(zhì)影響，如pH、極性、表面張力、添加表面活性劑、助溶劑、鹽等，而且受溫度和振蕩時間等溶解度實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響。

 




 

4.1緩沖液的組成

 

選擇溶解度測定的介質(zhì)與其應(yīng)用有關(guān)，當(dāng)結(jié)果旨在預(yù)測吸收或生物利用度時，建議使用一種生物相關(guān)的介質(zhì)溶液；當(dāng)結(jié)果旨在支持溶出方法開發(fā)時，建議使用溶出介質(zhì)。當(dāng)評估化合物的pH依賴性時，建議緩沖液在一個寬的pH范圍內(nèi)控制離子強(qiáng)度和反離子類型。弱酸和弱堿在介質(zhì)中的離子化程度取決于化合物的pKa值和介質(zhì)的pH。

 

4.2過量固體的量

 

藥物在溶液中達(dá)到平衡需要加入過量的固體，過量固體的量是否會影響平衡溶解度數(shù)值目前還沒有確定的結(jié)論。Kohsaku等考察了過量固體對吲哚美辛平衡溶解度的影響，pH5和6時平衡溶解度隨過量固體的量增加而減少，pH6.5和7時則相反，平衡溶解度隨過量固體的量增加而增加。

 

Edit等測定了每5mL介質(zhì)中分別過量4、8、12、16、20mg時氫氯噻嗪的平衡溶解度(圖1)，結(jié)果則沒有顯著差異。建議為了避免取樣困難，過量固體的量在保證足夠的基礎(chǔ)上不宜太多，例如每5mL介質(zhì)過量5～10mg即可。

 

4.3溫度

 

眾所周知，溶解度與溫度有關(guān)，因此平衡溶解度實(shí)驗(yàn)必須在恒定溫度下進(jìn)行。由于藥物有吸熱溶解的過程，溶解度會隨溫度的升高而增加，故大多數(shù)藥物在體溫37℃時的溶解度會**室溫25℃的溶解度。這在藥物設(shè)計中是一個優(yōu)勢，可以預(yù)期體內(nèi)有較好的生物利用度。因此體溫和室溫條件下測定得到的平衡溶解度數(shù)值是非常有用的數(shù)據(jù)支持。

 

4.4振蕩時間

 

振蕩是搖瓶法達(dá)到平衡的重要步驟，振蕩時間越長，藥物的溶解度越大，因此嚴(yán)格應(yīng)用搖瓶法的話，應(yīng)首先確定藥物達(dá)到平衡所需要的振蕩時間再測定溶解度。

 

4.5沉降時間

 

振蕩溶解后，需將多余的固體完全沉降后取上清液。研究表明，沉降時間對平衡溶解度的測定結(jié)果亦有影響。Edit等考察了分別沉降1～24h后取樣測定，結(jié)果有些出人意料。沉降1～8h測定的氫氯噻嗪溶解度數(shù)值較大，以沉降6h較大。而12h以后的溶解度卻顯著減小，有待考察是否由于測定誤差導(dǎo)致，見圖2。




 

4.6相分離技術(shù)

 

相分離技術(shù)是搖瓶法測定的關(guān)鍵部分。振蕩溶解后，溶液和固體兩相需要分離后取上清液進(jìn)行HPLC或UV等分析測定。取出的上清液必須完全澄清，不含任何固體粉末。

 

自然沉降被認(rèn)為是較安全的相分離技術(shù)，但其耗時長，且當(dāng)化合物形成膠束或聚合物產(chǎn)生乳白色溶液時，溶液則難以澄清，對于這種樣品，只有通過離心的方法來解決，因此離心或過濾的相分離技術(shù)也是一種很好的選擇。

 

然而選擇離心或過濾時有時可能會造成測定的平衡溶解度數(shù)值比真實(shí)值高，分析原因有：

 

①振蕩過程中有可能形成過飽和溶液，停止振蕩后立*濾或離心導(dǎo)致結(jié)果偏高；

 

②溶液中懸浮的粒子可能小于濾膜的孔徑，導(dǎo)致濾液的濃度偏高；

 

③固體粉末較為松散的話，離心后取上清液時可能會混入粉末，造成溶解度測定結(jié)果偏高。

 

5 小結(jié)

 

目前測定平衡溶解度沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，由于實(shí)驗(yàn)方法不同，導(dǎo)致了同一藥物不同來源的BCS分類存在差異。本研究詳細(xì)闡述了平衡溶解度實(shí)驗(yàn)的基本程序和技術(shù)要求，分析研究了影響溶解度測定的多方面因素，以規(guī)范平衡溶解度實(shí)驗(yàn)在BCS分類和生物等效性豁免中的應(yīng)用，希望對我國仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價工作的順利開展起到積極的作用。




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