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在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。

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直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，分子信標(biāo)（molecular beacon）就屬于這一類，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，結(jié)合在其兩端的熒光基團距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補序列出現(xiàn)時，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個開放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報告熒光基團與淬滅熒光基團彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團脫離了淬滅基團的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光。如采用常規(guī)的終點檢測法（利用EB染色來判斷擴增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng)PCR擴增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點熒光信號強度。




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QF-PCR技術(shù)在國外已有較廣泛的應(yīng)用，但目前尚未在國內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開展。為規(guī)范使用QF-PCR技術(shù)，由國家衛(wèi)生和計劃生育委i員會召集、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心主辦的"全國產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)管理規(guī)范編制研討會"于2015年11月14日在成都召開，會議就QF-PCR等快速產(chǎn)前診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用進展及其在國內(nèi)應(yīng)用中存在的具體問題進行了深入而廣泛的探討，并形成了QF-PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用*共識。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。

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熒光定量PCR較早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理： 隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測 產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。?




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隨著定量PCR儀設(shè)計上的不斷改進，對溫度控制的精密性越來越高，出現(xiàn)了像Rotor-Gene這樣的管間溫度均一性達±0.01℃的定量PCR儀，而該公司新近推出的Rotor-Gene6000較可達到±0.02℃的溫度分辨率。溫度上的高分辨率使得運用定量PCR儀進行高分辨率熔解曲線（HRM）分析基因型成為可能。高分辨率熔解曲線根據(jù)序列長度、GC含量和互補性分析樣品。另外，熒光定量PCR的結(jié)果*通過瓊脂糖凝膠電泳來評估，大大節(jié)省實驗時間，提高實驗效率。不同的核酸序列，哪怕僅有一個堿基的差異，也會體現(xiàn)在熔解溫度的差別上。

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PCR是1985年開始出現(xiàn)的一項基因檢測技術(shù),由于PCR技術(shù)具有簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究,成為分子生物學(xué)**的研究工具。但在許多情況下,研究者們已不再滿足于得知某一特異DNA序列的存在與否,他們較著眼于對其進行精i確的核酸定量。因而,借助PCR對基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確的定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點之一。二、應(yīng)急期間，比對符合要求的檢測試劑盒（試紙條）可使用至2019年6月30日。實時熒光定量PCR( real-time quantitative PCR, RQ PCR)技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,它以其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。




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