百螢課堂之蛋白印跡法常見問題及解答

時間：2024-05-29作者：西安百螢生物科技有限公司瀏覽：32

無信號

1、一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物種相同（一抗來自鼠，二抗便是抗鼠抗體）。

2、沒有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標(biāo)蛋白：使用高濃度抗體。4℃延長孵育時間。（如過夜）

3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)：使用溫和的去污劑，如吐溫-20，或換封閉劑（常用脫脂奶粉、BSA、、明膠）。

4、一抗不識別待檢物種的蛋白：參照說明書，對比原序列和蛋白序列以確保抗體和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng)。設(shè)置陽性對照。

5、蛋白上樣量不足：每條泳道蛋白上樣量不過20ug，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對照。

6、組織中目的蛋白含量低：濃縮使信號大化。

7、轉(zhuǎn)膜不充分：使用可逆染色劑轉(zhuǎn)膜效果，檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜需預(yù)先浸在中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。

8、洗膜過度：勿過度洗膜

9、過度封閉使目標(biāo)蛋白不能顯色：使用0.5％奶粉或無奶粉代替5％奶粉的抗體稀釋液?；驌Q封閉膜，減少封閉時間。

10、一抗失效：使用新鮮抗體，重復(fù)使用有效濃度會降低。

11、二抗受疊氮鈉抑制：避免疊氮鈉和HRP標(biāo)記抗體一起使用。

12、檢測試劑盒過期和底物失活：使用新鮮的底物。

背景高

1、未進(jìn)行特異性封閉或封閉不充分：延長封閉時間，考慮換合適的封閉劑。

2、一抗?jié)舛冗^高：稀釋抗體至合適濃度，以高稀釋度抗體延長孵育時間（耗時長，但特異性結(jié)合好）。

3、二抗與封閉劑非特異性結(jié)合或反應(yīng)：設(shè)置二抗對照（不加一抗）。

4、未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分：增加洗滌次數(shù)。

5、選膜不當(dāng)產(chǎn)生的高背景：纖維素膜比PVDF膜背景低

6、膜干燥：在孵育過程中防止膜變干，每一步都要保證膜有充分的反應(yīng)液，可放入攪拌子不斷攪動或輕輕震蕩使膜浸在溶液中。

多帶現(xiàn)象

1、細(xì)胞傳代次數(shù)過多，蛋白表達(dá)不同：使用原始未傳代的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做平行對照實(shí)驗(yàn)。

2、體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：參考文獻(xiàn)，使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來證明翻譯后的修飾。

3、蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）：在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。

4、檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白：查閱其他文獻(xiàn)報道，或BLAST搜尋，使用說明書的細(xì)胞株或組織。

5、一抗?jié)舛冗^高，高濃度時常出現(xiàn)多條蛋：降低蛋和/或孵育時間。

6、二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合：降低抗體濃度，加入二抗對照（不加一抗）。

7、抗體未經(jīng)純化：使用親和純化的抗體，減少非特異條帶。

8、目標(biāo)蛋白形成多聚體：SDS-PAGE電泳加樣前，煮沸10 min而不是5 min，使蛋白質(zhì)解聚。

背景有不均勻的白色斑點(diǎn)

轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡或抗體在膜布不均：轉(zhuǎn)膜過程中盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動。

背景有黑色斑點(diǎn)

抗體結(jié)合了封閉劑：過濾封閉劑

深背景出現(xiàn)白色條帶

一抗或二抗加入過多：稀釋抗體的濃度

目的條帶染色過低/過高

分離不

改變凝膠比例：分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。

條帶“微笑”效應(yīng)

遷移過快

電泳溫度過高（改變了PH值和遷移速度）。降低遷移速度或低溫電泳。（冷庫或冰上）。

相同蛋白雜交出現(xiàn)了不均勻條帶

制備凝膠時，凝膠凝固太快，致使泳道中的比例不均勻。

參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量TEMED，放置時在凝膠部加入適量1％SDS（水稀釋）以防凝膠變干。

凝膠染色不均勻

細(xì)菌污染：4℃保存抗體并使用新鮮的緩沖液浸泡膠體。

抗體量不足：確保振蕩條件下孵育膜或抗體充分覆蓋膜。


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