如何高效培養(yǎng)人多能干細(xì)胞

時間：2019-06-27作者：上海埃澤思生物科技有限公司瀏覽：71

    人多能干細(xì)胞(hPSCs)因其擁有分化為機(jī)體所有類型細(xì)胞的能力，使得hPSCs成為研究發(fā)育機(jī)制以及疾病機(jī)理較常用的工具，同時在再生醫(yī)學(xué)以及疾病**領(lǐng)域也有非常廣泛應(yīng)用。人多能干細(xì)胞因其來源不同又可分為胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）。
      小鼠胚胎干細(xì)胞由Martin Evans在1970年**從小鼠胚囊中分離獲得，小鼠胚胎干細(xì)胞就可以成功地在體外進(jìn)行培養(yǎng)。人的胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)在1998年由美國科學(xué)家James Thomson培養(yǎng)成功。
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是日本科學(xué)家山中伸彌（Shinay Yamanaka）團(tuán)隊(duì)在2006年利用病毒載體將Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc四個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程而成。iPS細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、基因蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾以及畸胎瘤形成能力與胚胎干細(xì)胞非常相似。2007年11月，山中伸彌實(shí)驗(yàn)室成功將人類皮膚纖維母細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞。2009年我國科學(xué)家周琪院士與曾凡一教授，**利用iPS細(xì)胞，通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，世界上**證明了iPS細(xì)胞的**性。
     下面對多能干細(xì)胞不同培養(yǎng)體系以及傳代方法進(jìn)行分析：
     多能干細(xì)胞較常見的培養(yǎng)體系有可以分為有血清培養(yǎng)系統(tǒng)跟無血清培養(yǎng)系統(tǒng)：
     有血清系統(tǒng)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配干細(xì)胞級血清，同時添加bFGF等生長因子，此方法對血清要求較高，在目前國內(nèi)血清比較亂的情況下，購買的合格的血清是制約細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素，同時該體系還需要滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)方法較復(fù)雜。
     無血清干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)明大大簡化了干細(xì)胞培養(yǎng)流程，目前常用的為Gibco Essential8培養(yǎng)基與Stemcell Technologies 的mTesR系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)均為無血清，不需要額外添加生長因子，同時擺脫了滋養(yǎng)層細(xì)胞的限制，通過包被培養(yǎng)板就可以達(dá)到細(xì)胞貼壁的目的。但是，以上兩種培養(yǎng)基價格不菲，同時因?yàn)楹信Ｑ灏椎鞍祝˙SA）經(jīng)常會有進(jìn)口限制。以上產(chǎn)品也均有國內(nèi)替代，Applied Cell分別有人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（適用于Essential8 系統(tǒng)），以及Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(適用于mTesR系統(tǒng))。
     培養(yǎng)皿包被：目前有兩種常見的包被方法，分別為Matrix基質(zhì)膠包被以及 Vitronectin包被，以上兩種膠對溫度非常敏感，操作要求較高，需要全程低溫操作，同時現(xiàn)配現(xiàn)用。針對以上問題現(xiàn)在多家公司均有有即用型基質(zhì)膠（Gibco,Stemcell Tech,Applied Cell）推出。
     傳代：干細(xì)胞傳代經(jīng)過多年發(fā)展也逐步簡化，較初通過膠原酶消化，挑克隆法傳代；后續(xù)發(fā)展出機(jī)械傳代發(fā)，多家公司也推出了細(xì)胞切割工具；至目前已經(jīng)可以做到使用消化液完成消化，消化液種類也多種多樣，分別有Accutase,Tryple以及無酶消化液，均可以達(dá)到很好的傳代效果。
    以下另附多能干細(xì)胞培養(yǎng)操作手冊：
人類iPS/ES細(xì)胞復(fù)蘇操作：
      人類iPS/ES細(xì)胞的復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作包括實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作和實(shí)驗(yàn)過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細(xì)胞的復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作：
1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：
1.1  基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實(shí)驗(yàn)前拿出并置于**凈工作臺/生物*柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。
注意：①干細(xì)胞復(fù)蘇過程中的基質(zhì)膠鋪板數(shù)由凍存細(xì)胞密度決定，一支凍存的干細(xì)胞的密度在1×106cells/mL左右，需要6孔板鋪1孔或12孔板鋪2孔基質(zhì)膠；②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。
1.2  實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000）在實(shí)驗(yàn)前置于室溫中避光平衡30min~1h。
1.3  **凈工作臺/生物*柜照射紫外：在實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。
1.4  恒溫水浴鍋準(zhǔn)備：水浴鍋溫度設(shè)置在37℃用于hPSC細(xì)胞復(fù)蘇。
2. 實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
2.1  提前加入人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000）：復(fù)蘇前，先在15mL離心管中加入2~3mL的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基備用。
2.2  解凍：將從中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；
注意：細(xì)胞從中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。
2.3  離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其吸出并緩慢逐滴滴入提前在15mL離心管中加入的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000rpm/min離心3min；
2.4  重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000） 對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。
2.5  接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細(xì)胞懸液，緩慢吹吸3~5次，待細(xì)胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補(bǔ)全每孔2 mL/1 mL的培養(yǎng)體系。
2.6  培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；
2.7  換液：從復(fù)蘇的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。
      人類iPS/ES細(xì)胞擴(kuò)增操作：
人類iPS/ES細(xì)胞的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)操作包括實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作和實(shí)驗(yàn)過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細(xì)胞的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)操作：
1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：
1.1  基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，根據(jù)細(xì)胞密度決定傳代的孔數(shù)（細(xì)胞密度中等則可以按照1:2傳代，密度大則按照1:3或4傳代），并在每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實(shí)驗(yàn)前拿出并置于**凈工作臺/生物*柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。
注意：①通常早代次(<10代)的干細(xì)胞需要以較低的比例傳代，如1:2-1:3；成功建系的干細(xì)胞（10代以上）可以1:4-1:5的比例傳代，傳代的比例由細(xì)胞株的生長速率決定。比較理想的傳代時間間隔是3-5天一次，剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞**次傳代時間一般是復(fù)蘇后第5天。②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。
1.2  實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000）、人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008 ）以及PBS緩沖液在實(shí)驗(yàn)前置于室溫中避光平衡30min~1h。
1.3  **凈工作臺/生物*柜照射紫外：在實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。
2.  實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入1 mL/0.5 mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；
2.2  消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO2培養(yǎng)箱中2~5 min；
注意：消化時間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時間可以控制在3 min~5min，消化時間快結(jié)束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。
2.3  吹打：吸掉人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的2mL/1mL干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細(xì)胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細(xì)胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；
注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
2.4  接種：待皿底的細(xì)胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細(xì)胞懸液，緩慢吹吸1~2次，待細(xì)胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補(bǔ)全每孔2mL/1mL的培養(yǎng)體系。
2.5  培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；
2.6  換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。
人類iPS/ES細(xì)胞凍存操作：
人類iPS/ES細(xì)胞的凍存標(biāo)準(zhǔn)操作包括實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作和實(shí)驗(yàn)過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細(xì)胞的凍存標(biāo)準(zhǔn)操作：
1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：
1.1  實(shí)驗(yàn)試劑平衡： 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000）、人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）以及PBS緩沖液在實(shí)驗(yàn)前置于室溫中避光平衡30min~1h。
1.2  **凈工作臺/生物*柜照射紫外：在實(shí)驗(yàn)前打開紫外燈照射30min進(jìn)行滅菌。
2. 實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
2.1  清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入2mL/1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；
2.2  消化：在6孔板/12孔板中加入2mL/1mL人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO2培養(yǎng)箱中 2~5min；
注意：消化時間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時間可以控制在3 min~5min ，消化時間快結(jié)束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。
2.3  吹打：吸掉人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的 1~2 mL人類多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細(xì)胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細(xì)胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；
注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
2.4  離心：待皿底的細(xì)胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000 rpm/min離心3 min；
2.5  重懸：離心后棄上清，加入1 mL Serum-Free干細(xì)胞凍存液（AC-1001011/AC- 1001012）對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到1.8mL凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時放回4℃冰箱。通常生長狀態(tài)相同且同時消化的細(xì)胞統(tǒng)稱為一批細(xì)胞。
2.6  記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時間、操作者及細(xì)胞批次。
2.7  -80℃冰箱平衡：凍存管置于-80℃冰箱過夜。
 注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。
2.8  凍存：凍存管置于 -80℃冰箱過夜后，第2天將其置于中進(jìn)行長期保存/NewsInfo.aspx?id=21


上海埃澤思生物科技有限公司專注于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,多能干細(xì)胞培養(yǎng)基,無血清細(xì)胞凍存液等

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  詞條說明

• 埃澤思生物通過GB/T19001-2016/ISO9001：2015質(zhì)量體系認(rèn)證

  為進(jìn)一步提升埃澤思生物質(zhì)量管理以及運(yùn)營管理水平，近日埃澤思生物進(jìn)行了GB/T19001-2016/ISO9001：2015質(zhì)量管理體系認(rèn)證，認(rèn)證范圍為細(xì)胞培養(yǎng)試劑工藝優(yōu)化。 審核為期一周，在審核過程中，公司各部門將日常工作情況真實(shí)的展現(xiàn)給認(rèn)證*，并對工作中遇到的問題向各位審核*請教，共同探討解決方案，并向*咨詢以后工作中較規(guī)范較有效的工作以及管理方法，以促進(jìn)經(jīng)營過程中合法合規(guī)，審核*敬業(yè)

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• 細(xì)胞**之無血清細(xì)胞凍存

  在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞凍存是較關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，尤其在細(xì)胞**、細(xì)胞存儲中對細(xì)胞凍存較有特殊要求，下面就根據(jù)降溫速度以及凍存液組分對細(xì)胞凍存做詳細(xì)介紹。 根據(jù)降溫速度區(qū)分，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。根據(jù)凍存方式不同可以分為慢速凍存（程序降溫法）與快速凍存（非程序降溫法）。 程序降溫凍存技術(shù)要點(diǎn)是慢凍，標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2/℃ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增至-5

• 如何高效培養(yǎng)人多能干細(xì)胞

  人多能干細(xì)胞(hPSCs)因其擁有分化為機(jī)體所有類型細(xì)胞的能力，使得hPSCs成為研究發(fā)育機(jī)制以及疾病機(jī)理較常用的工具，同時在再生醫(yī)學(xué)以及疾病**領(lǐng)域也有非常廣泛應(yīng)用。人多能干細(xì)胞因其來源不同又可分為胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）。 小鼠胚胎干細(xì)胞由Martin E