計(jì)時(shí)電位法測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性

時(shí)間：2019-07-18作者：蘇州亞科科技股份有限公司瀏覽：179

乙酰膽堿酯酶(AChE)是與神經(jīng)功能相關(guān)的一種酶，在醫(yī)學(xué)上，血液膽堿酯酶活性測(cè)定是急性**磷農(nóng)藥中毒診斷和療效觀察的重要參考指標(biāo)。目前，測(cè)定膽堿酯酶活性的常用方法是比色法(Ellman法)該法從樣品處理到完成測(cè)定大致需要60~90min，分析速度較慢，因此，研究快速測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性的方法非常必要。
 
儀器與試劑
LK98A-微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)；XW-80A旋渦混合器；SYC-15**級(jí)恒溫水??；恒溫電解池(自制)；電極：鉑對(duì)電極，飽和甘汞電極。
 
乙酰膽堿酯酶(EC3.1.1.7，VI-S型，來自電鰻，500U/mg，Sigma)；底物：碘化乙酰硫代膽堿（別名：碘化硫代乙酰膽堿，cas:1866-15-5，亞科貨號(hào)：D0007），使用時(shí)用0.1mol/L，PH7.4的Tris-HCl緩沖液配成0.002mol/L的溶液，4℃下保存。水為二次蒸餾水。
 
實(shí)驗(yàn)方法
1、測(cè)定條件
檔位選擇：恒電流；靈敏度選擇:10mA；濾波參數(shù):10~Z；階躍電流：0.020mA；放大倍率：1；采樣點(diǎn)數(shù)：8000；采樣間隔：320ms；水浴溫度:26℃
 
2、實(shí)驗(yàn)步驟
移取8.0mL底物溶液于恒溫電解池中，攪拌平衡5min。加入一定量的AChE，在上述條件下進(jìn)行電解9記錄Et曲線，測(cè)量Et曲線上突躍部分的斜率△E/△t。
 
實(shí)驗(yàn)原理
以碘化乙酰硫代膽堿作底物，向電解池的兩支鉑電極上施加一個(gè)恒定的微電流進(jìn)行電解。因底物中的I-被氧化為I2而獲得一個(gè)穩(wěn)定的電位(約0.45V)。當(dāng)加入乙酰膽堿酯酶時(shí)，由于酶促水解所產(chǎn)生的硫醇比底物具有較大的電活性，能在較低電位下(約0.25V)氧化，于是形成電位的降落。記錄電解過程中電位E隨時(shí)間t的變化值，得到一條典型的S型曲線。該去較化曲線的斜率dE/dt反映了水解速率，即酶的催化速率。在一定條件下，酶活性越強(qiáng)，酶促反應(yīng)越快，去較化曲線的斜率dE/d越大。因此，利用校準(zhǔn)曲線可計(jì)算待測(cè)酶的活性。
 
活力校準(zhǔn)曲線
在上述確定的較佳條件下，加入不同量(0.02U、0.03U、0.04U、0.05U、0.06U)的商品AChE，分別測(cè)定其△E/△t值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，所得直線方程為Y=-0.3236+35.59X，其相關(guān)系數(shù)r=0.9920。E~t曲線上突躍部分的斜率值△E/△t與酶量之間存在著良好的線性關(guān)系。利用校準(zhǔn)曲線可對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。
 
固定化酶片活性的測(cè)定
采用戊二醛交聯(lián)法將AChE固定到商品載體膜上，制成固定化酶片，在上述確定的較佳條件下測(cè)定，不同酶用量時(shí)的酶片活性，結(jié)果見表1
 
 
由表1 數(shù)據(jù)可見，采用電化學(xué)計(jì)時(shí)電位法測(cè)定固定化乙酰膽堿酯酶活性，方法穩(wěn)定、可靠。
 
結(jié) 論
采用電化學(xué)計(jì)時(shí)電位法測(cè)定乙酰膽堿酯酶的活性，酶量與其活性值△E/△t之間呈良好的線性關(guān)系，對(duì)固定化乙酰膽堿酯酶片獲得了滿意的測(cè)定結(jié)果。與其他方法相比，該法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好。
 

相關(guān)鏈接：碘化乙酰硫代膽堿
          Tris-HCl
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