游離DNA提取方法

時間：2022-04-10作者：南京兔牙生物科技有限公司瀏覽：670

游離DNA提取方法

【操作方法-離心法】

使用前先在Buffer W1和Buffer W2中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標(biāo)簽。
1. 加1.44 mL Buffer L1至5 mL離心管中，并加入40 μL蛋白酶K。
2. 加入1.8 mL血漿或尿液樣本，蓋上管蓋，旋渦振蕩30秒，60℃孵育30min。
*如果尿液 體積不足1.8 mL mL，則必須補(bǔ)加生理鹽水使尿液體積達(dá)到1 mL。
3. 加入1 mL 異丙醇，顛倒混勻離心管3－5次，-20℃保存5-10min。
4. 將步驟3中的上清液倒入到核酸純化柱中（核酸純化柱置于2mL 離心管中），蓋上管蓋，12000 rpm 離心30秒，若體積過多，一次過濾不完，可重復(fù)該步驟，直至步驟3中溶液完全過完純化柱（不用更換過濾柱）。
5. 棄除濾液，將核酸純化柱置回到2mL 離心管中，在核酸純化柱中加入500 μL Buffer W1, 蓋上管蓋，12000 rpm 離心30秒。
* 確認(rèn)在Buffer W1 中已經(jīng)加入無水乙醇。
* 濾液無須徹底棄盡，如果要避免粘附在離心管管口的濾液對離心機(jī)的污染，可將2mL 離心管在紙巾上倒扣拍擊一次。
6. 棄2mL 離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL 離心管中，在核酸純化柱中加入500 μL Buffer W2, 蓋上管蓋，12000 rpm 離心30秒。
* 確認(rèn)在Buffer W2中已經(jīng)加入無水乙醇。
7. 棄2mL 離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL 離心管中，在核酸純化柱中加入500 μL無水乙醇, 蓋上管蓋，12000 rpm 離心1分鐘。
8. 棄2mL 離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2mL 離心管中，14000 rpm 離心3分鐘。
* 如果離心機(jī)的離心速度達(dá)不到14000 rpm，則用較高速離心4分鐘。
* 請勿省略該步驟，否則可能因所純化的核酸中混有乙醇而影響后續(xù)的PCR效果。
7. 棄2mL 離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 mL 離心管中，在純化柱中加入50-100 μL 60℃溫育的Buffer TE或水，蓋上管蓋，室溫靜置3分鐘，12000 rpm 離心1秒。
* 如果離心機(jī)沒有防泄漏的蓋子，請將離心條件改為8000 rpm離心1分鐘，以免管蓋脫落而損傷離心機(jī)。
8. 棄純化柱，洗脫的DNA可立即用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，或者將DNA儲存于-20℃?zhèn)溆谩?br>

【操作方法-真空抽濾法】
使用前先在Buffer W1和Buffer W2中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標(biāo)簽。
1. 加1.44 mL Buffer L1至5 mL離心管中，并加入40 μL蛋白酶K。
2. 加入1.8 mL血漿或尿液樣本，蓋上管蓋，旋渦振蕩30秒，60℃孵育30min。
*如果樣本體積不足1.8 mL mL，則必須補(bǔ)加生理鹽水使樣本體積達(dá)到1.8 mL。
3. 加入1 mL 異丙醇，顛倒混勻離心管3－5次，-20℃保存5-10min。
4. 將過濾柱插入到真空泵系統(tǒng)的上，在過濾柱上放置20 ml的擴(kuò)容管。
*保證補(bǔ)充管完全插入到過濾柱上，避免樣品漏出。
5、小心地將第3步得到的裂解液的混合液加入到在過濾柱上的擴(kuò)容管中，打開真空泵。當(dāng)所有的裂解液完全通過柱子后，小心取下補(bǔ)充管，丟棄。
*為了避免交叉污染，在相鄰的過濾柱間移動時務(wù)必小心操作。
6. 將500 μL Buffer W1加入到過濾柱中，保持柱子是打開狀態(tài)，在所有的Buffer W1完全通過了過濾柱后。
7. 將500 μL Buffer W2加入到過濾柱中，保持柱子是打開狀態(tài)。在所有的Buffer W2完全通過了過濾柱后。
8. 將500 μL的乙醇(96–**) 加入到過濾柱中，保持柱子是打開狀態(tài)。在所有的乙醇完全通過了過濾柱后，關(guān)掉真空泵。
9. 關(guān)閉上過濾柱，從真空泵上取下。將過濾柱放置在一個干凈的 1.5 ml收集管中，全速(20,000 x g; 14,000 rpm)離心3 min。
10. 將過濾柱置于一個1.5 ml收集管中，打開蓋子，室溫干燥2-3分鐘。
11. 小心地將50–100 μL的Buffer TE或水加入到過濾柱膜*，蓋上蓋子，室溫孵育3 min。
注意：保證Buffer TE或水已經(jīng)平衡至室溫(15–25°C)。如果洗脫液體積比較小(<50 μl)，那么應(yīng)該將洗脫液加入到膜*，保證能完全洗脫結(jié)合的DNA。洗脫體積是可以根據(jù)下游的不同應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整的。
12. 全速(20,000 x g; 14,000 rpm)離心1 min，洗脫核酸。


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