提取糞便樣品微生物DNA

時間：2014-12-19

作者：深圳市安必勝科技有限公司【字號：大中小】

我們常會收到剛開始入手糞便微生物組學研究者關于微生物提取的推薦處理程序、預期得率，以及合適的儲存方法、運輸條件等問題。

所以，為了幫助你們較好地規(guī)劃實驗，我們努力從糞便DNA提取和微生物組學分析*那里收集相關技巧，讓你可快速開展自己的微生物組學實驗。

為了收集這方面的較有利信息，我們采訪了主持Human Microbiome Project（HMP）樣品收集和DNA提取流程開發(fā)的貝勒醫(yī)學院分子病毒學和微生物學副教授Joseph Petrosino；微生物DNA提取試劑盒良好者MOBIO研發(fā)部主管Suzanne Kennedy；TGA Sciences研發(fā)助理研究員Kate Patterson。

以下五點來源于他們實驗室的經驗將有助于你項目的順利開展。

1、采樣

對于嚙齒動物，較簡單直接的辦法是收集糞粒。動物關在籠子里，帶上無菌手套撿拾籠舍底面的糞粒，放入到BD Falcon? 或Eppendorf Tube管這樣的無菌裝置中即可。

收集人的糞便樣品或許有點臟。所以許多實驗室提供一種桶狀的裝置，可放置在座廁下收集樣品。也可以用報紙接著樣品，以吸收更多水分。關鍵是要提供適當指導，避免樣品受到廁紙或廁所壁的污染。指導也應該包括建議先排尿，避免尿液污染糞便樣品。

若要收集肛周棉拭子，確認使用的是滅菌棉拭子，采樣風干一個小時后放到帶帽的無菌運輸容器，避免微生物冷凍保存前降解。

2、樣品運輸與保存

樣品收集后在DNA提取前可一直放在同一個容器里運輸和保存。或者分裝后放入到特殊滅菌收集容器中。

若樣品是在家里自行收集的，應把樣品容器放入到家庭冰箱中。快遞到實驗室時用冰袋保溫。實驗室中收集的樣品可馬上冷凍保存。HMP項目，要求樣品在特定的收集容器中-80℃冷凍保存，24-48h內提取DNA。也有*觀察到冷凍保存長達一年的樣品的微生物多樣性與現(xiàn)場馬上提取的區(qū)別不大。做微生物多樣性，我們的*一致認為，用Qiagen的RNALater這類的保護液會影響下游DNA提取，請避免使用。有*觀察到使用RNALater的糞便樣品容易分層，DNA回收率下降。(糞便樣品運輸包裝.PDF)

重復樣品分析可以減少處理過程、稱重等環(huán)節(jié)帶來的誤差。但是在嚴格遵循較佳實驗室規(guī)范、質量管理系統(tǒng)進行的微生物分析質量控制和質量保證程序下，*重復樣品。PhloChip分析也內建了質量控制程序保證分析結果。

3、分開處理健康與患病個體糞便

按照BSL-2規(guī)定條件分別處理健康與患病個體，包括戴好面具、手套及穿著實驗室工作服，避免潛在病原感染。

便秘個體糞便在后續(xù)DNA提取中需要適當延長珠磨研磨時間，稀糞需要離心去除多余液體。

4、DNA提取

現(xiàn)有很多種方案從糞便樣品中提取微生物DNA，而我們所有的*都推薦使用珠磨研磨法和MOBIO的PowerSoil? DNA Isolation Kit。非珠磨研磨法無法回收格蘭性陽性菌DNA。使用MOBIO的PowerSoil? Isolation Kit，較終洗脫DNA濃縮了為微生物DNA，PCR敏感度較高。人或動物的真核細胞在加熱和珠磨研磨的環(huán)境下比微生物細胞較快裂解，DNA釋放游離在上清液中。游離的DNA在長時間的機械作用力下斷成小片段，綁定吸附步驟被沖洗掉。微生物DNA保存大分子片段狀態(tài)留在硅膠離心柱上。

我們的*們觀察到PowerSoil? Kit這類采用珠磨研磨技術的試劑盒提取0.1g糞便樣品約可獲得100μl 2-20ng/μl 的總基因組DNA。人糞便或者腸內容物建議加樣0.1-0.25g。較為干燥的老鼠糞便，建議減少加樣量到0.1g。推薦使用試劑盒自帶的研磨珠，沒必要另外購買玻璃或者二氧化硅研磨珠。

有*觀察到人糞便DNA中約有2%的人類DNA。相反，其它類型的樣品如陰道棉拭子提取的DNA較多可含80%人類DNA。

5、去除PCR抑制因子

糞便與土樣一樣帶有大量PCR抑制因子。抑制因子的種類因飲食結構而異。抑制因子會吸附到離心柱硅膠濾膜上，伴隨DNA一并被洗脫下來。這類樣品的總DNA常呈黃至棕色，分光光度法讀數(shù)偏低。因此，我們推薦使用MOBIO含有抑制因子去除技術?（IRT）的PowerSoil? DNA Isolation Kit，在綁定樣品到離心柱前，去除裂解物中腐植酸、多、多糖、亞鐵血紅素和染料等雜質，可獲得高純度的DNA，擴增后得到較準確的微生物群落結構信息。

6、最后

參考文獻

1. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gelelectrophoresis. Julia R. deLipthay et al. (2004) Soil Biology and Biochemistry. 36;10:1607-1614.

2. Manual of Procedures for Human Microbiome Project.

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