為什么說從糞便樣品中提取DNA非常類似于提土壤

時(shí)間：2014-08-21作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：247

作者：Suzanne kennedy 來源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室【字號(hào)：大 中 小】

我們收到了許多研究者關(guān)于提取糞便樣品（fecal sample）DNA的咨詢電話。在此，提供一些關(guān)于糞便（stool）DNA提取的小建議。

糞便含有種類較其豐富的微生物群體，而每個(gè)人腸道內(nèi)菌群又不一樣。糞便菌群的不同影響因素有很多。其中飲食結(jié)構(gòu)對(duì)糞便的成分和性狀影響較大。素食者糞便中含有大量多糖、植物纖維，因此抑制因子也較多。使用抗生素干擾了腸道菌群的生存，改變了樣品中細(xì)菌的含量和分布。同樣，壽司等生冷食物也會(huì)對(duì)腸道微生物造成沖擊。

糞便樣品跟土壤比較類似，包含的微生物種類跟采樣地點(diǎn)有關(guān)。同樣的含有大量各種抑制因子。不同的樣品性狀還影響后續(xù)處理方法。它們更多共通點(diǎn)在于，如果你處理的是表土，樣品中會(huì)混雜一些土棲蠕蟲、鳥的排泄物，或者其它小型動(dòng)物。這就是為什么MoBio的土壤DNA提取試劑盒也同樣適合于糞便樣品。

根據(jù)樣品類型不同，MoBio有好幾個(gè)試劑盒適合處理糞便類物質(zhì)。糞便DNA提取（UltraClean Fecal DNA Kit）適合于抑制因子不多的樣品。強(qiáng)力土壤DNA提取（PowerSoil Kit）是處理含大量的PCR抑制因子樣品的可以選擇。同時(shí)，它也是人類腸道微生物基因組研究計(jì)劃推薦處理辦法。不過有幾個(gè)步驟需要做改動(dòng)。

操作說明書：

人體腸道微生物基因組研究計(jì)劃已經(jīng)在其網(wǎng)站底部"Metagenomic WGS"部分公布了一套核酸提取標(biāo)準(zhǔn)操作步驟。

打開操作說明書*65頁，描述了強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）的實(shí)驗(yàn)操作。

該操作說明書里頭，HMP研究者把搜集的2ml樣品加入到50ml Tube管中，并加入5ml研磨緩沖液[Bead Solution（cat# 12988-10-BS）]，然后分裝。

如果手上只有一個(gè)樣品需要處理。建議直接把糞便樣品加入到PowerSoil Kit的厚壁研磨管中（PowerBead tube），渦旋振蕩30~40s混勻樣品。

下一步加熱，以加強(qiáng)對(duì)微生物細(xì)胞裂解。

65℃加熱10分鐘，然后95℃加熱10分鐘。

加熱處理后，接著按照強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。其中只需要在*12步稍作改動(dòng)。即加入C3后離心時(shí)間由1分鐘增加到2分鐘。

DNA較終體積為100ul，可以不經(jīng)處理進(jìn)行基因測(cè)序。

糞便樣品狀態(tài)較接近于粘土，因此使用PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit可能會(huì)**較好的提取效果。較近MoBio在研究使用玻璃研磨珠對(duì)提取粘土DNA得率進(jìn)行改進(jìn)。有了結(jié)果以后將**時(shí)間公布結(jié)果。

工作原理：

有個(gè)理論可以解釋，為什么強(qiáng)力土壤DNA提取（PowerSoil）和糞便DNA提取（UltraClean Fecal）提取糞便樣品效果如此的好（拋開IRT除抑制因子步驟不說），使得較終得到的DNA絕大部分為微生物DNA。研磨珠擊打階段前，人類細(xì)胞已經(jīng)在上述加熱步驟被裂解了。而微生物細(xì)胞需要研磨珠擊打破碎。游離的人類DNA在研磨珠擊打步驟被迅速切開降解，微生物DNA依然保持大分子結(jié)構(gòu)。

試劑盒中DNA吸附綁定階段，使用的C4結(jié)合溶液（binding solution）只會(huì)捕捉大分子的DNA。RNA和小片段破碎DNA將在清洗階段被除去。這意味著進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)的較終DNA中絕大部分為微生物DNA。在進(jìn)行基因測(cè)序的時(shí)候，檢測(cè)到的信息主要就是關(guān)于腸道微生物的了。

糞便RNA

想提取糞便樣品中的RNA，請(qǐng)使用PowerMicrobiome?糞便RNA提取試劑盒（PowerMicrobiome? Fecal RNA Isolation Kit）（請(qǐng)參看下文參考文獻(xiàn)）。該試劑盒一次可從大體積樣品中提**到更多總RNA。如果你希望提取小量糞便樣品，請(qǐng)與我們聯(lián)系（anbiosci@）。

人類腸道微生物相關(guān)文獻(xiàn)：

·      Dominguez-Bello, M.G., E.K. Costello, M. Contreras, M. Magris, G. Hidalgo, N. Fierer, R. Knight. In Press. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the founder microbiota across multiple body habitats in newborns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Jun 2010; 10.1073/pnas.1002601107.

·      Fierer, N., C.L. Lauber, N. Zhou, D. McDonald, E.K. Costello, R. Knight. 2010. Forensic identification using skin bacterial communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 6477-6481.

·      Costello, E.K., C.L. Lauber, M. Hamady, N. Fierer, J.I. Gordon, R. Knight. 2009. Bacterial variation in human body habitats across space and time. Science. 326: 1694-1697

RNA PowerSoil Kit 提取糞便樣品

·      Exfoliated Cells in Stool: A Source for Reverse Transcription-PCR–Based Analysis of Biomarkers of Gastrointestinal CancerYing Jie Yu, Adhip P.N. Majumdar, Jordan M. Nechvatal, Jeffrey L. Ram, Marc D. Basson, Lance K. Heilbrun, and Ikuko Kato. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.,Feb 2008; 17: 455 – 458.

 


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