修改說明書使用MOBIO試劑盒提取新鮮組織或FFPE樣品的microRNA

時(shí)間：2014-08-21作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：98

來源：深圳市安必勝科技有限公司 轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處【2013-06-21】

我們從之前的文章中已經(jīng)知道了如何使用我們的離心柱型試劑盒快速簡便地從組織中提取RNA 。

但我們還是經(jīng)常被問到組織樣品microRNA（miRNA）的提取。MicroRNAs是長度約為22個(gè)核苷酸的小分子RNA，通過結(jié)合到mRNA 3'端非編碼區(qū)，通常在蛋白翻譯水平上抑制基因表達(dá)。在基因表達(dá)調(diào)整上起重要作用。每個(gè)miRNA可以抑制上百個(gè)靶mRNAs（1），miRNAs的錯(cuò)誤表達(dá)常與疾病相關(guān)。正因?yàn)樗鼈儗?duì)基因表達(dá)的重要調(diào)控作用，目前miRNA研究主要方向集中在癌癥**上（2）。

miRNA提取并沒有那么復(fù)雜

miRNAs的小片段特性意味著需要調(diào)整試劑配方，增強(qiáng)硅膠離心柱對(duì)小片段的吸附綁定。目前的配是方針對(duì)信使RNA的，丟棄了tRNA和小片段RNAs，對(duì)檢測低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)錄本帶來相當(dāng)難度。因?yàn)?/span>5s和tRNA占總RNA 20%之多，丟棄前者相當(dāng)于富集了信使RNA， 幸運(yùn)的是，捕捉小片段RNA并不難。硅膠吸附技術(shù)中，影響濾膜綁定效果的有兩個(gè)因素：胍酸鹽和濃度。通過修改綁定步驟中的濃度，我們可以吸附綁定大多數(shù)小片段RNA，而通常情況下它們會(huì)被沖洗掉。主要稍微簡單修改就能解決問題，何必多花錢另外買一個(gè)試劑盒呢？

提取步驟

以下是使用UltraClean Tissue & Cells RNA Isolation Kit同時(shí)回收mRNA和miRNA的操作步驟：

1、按照原說明書均質(zhì)化樣品，沖洗裂解物。 2、加入1.5倍體積的**到裂解物中。 3、接著步驟繼續(xù)。

非常簡單，若Solution TR1（裂解緩沖液）在開始加了300μl，** 用450μl。若Solution TR1加了600μl，** 加900μl。

正常情況下這步加入70%到裂解物中，的濃度使得mRNA和tRNA都被吸附綁定，小片段RNA（＜200堿基)將被沖洗掉。你要找轉(zhuǎn)錄本，這么做就可以了。但如果你要做的是降解了的RNA，希望捕捉所有小片段RNA或miRNA，增加濃度就行。

從FFPE組織提取RNA

在談到降解RNA的時(shí)候，我想到了另一個(gè)話題，那就是從福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣品中提取RNA，FFPE樣品中的RNA大多是小片段的。如果你要用試劑盒來提，你要用高濃度的酒精來綁定RNA。

通過改動(dòng)四個(gè)主要步驟，你也可以用UltraClean FFPE Tissue DNA Isolation Kit提取FFPE組織RNA。

首先是為了提RNA而選用的另一種消化用裂解緩沖液。這個(gè)新的裂解緩沖液可以在加熱消化組織、去除蛋白交聯(lián)的過程中保護(hù)RNA（*去除石蠟）， 用于去蛋白交聯(lián)的水浴溫度調(diào)整為70℃，時(shí)間為30min（替代DNA的90℃ 1個(gè)小時(shí)）（3）。

與裂解物的體積比增加到2：1，以在鹽環(huán)境下把所有RNA都綁定在濾膜上。

最后，在洗脫前用on-spin Column DNase Kit去除離心柱濾膜上的基因組DNA。

FFPE DNA Kit的其它組分都是一樣的。

總結(jié)

有那么多適用于RNA的試劑盒，現(xiàn)在很難去對(duì)比操作步驟，哪個(gè)較合適。方法并沒有那么復(fù)雜，所以如果一個(gè)試劑盒就能解決問題，為什么要買兩個(gè)試劑盒來提一個(gè)RNA呢？化學(xué)試劑的成分都是一樣的，為什么為了miRNA，要付出比提總RNA更多的錢呢？

如果你在研究miRNA，嘗試中有任何問題，請(qǐng)隨時(shí)聯(lián)系我們。

參考文獻(xiàn)：

1. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P., Grimson, A., Schelter, J. M., Castle, J., Bartel, D. P., Linsley, P. S., and Johnson, J. M. (2005). Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433, 769-773.

2. Li, C; Feng, Y; Coukos, G; Zhang, L (2009). "Therapeutic microRNA strategies in human cancer". The AAPS journal 11 (4): 747–57

3. Norikazu Masuda, Tadashi Ohnishi, Shoko Kawamoto, Morito Monden, and Kousaku Okubo (Nov 1999). Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res., Nov 1999; 27: 4436 – 4443.

 


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